Jasnije razumevanje markera i pokretača proliferacije ćelija raka proizašlo je iz istraživanja koje identifikuje nove mogućnosti za prevazilaženje konvergencije sa složenim enzimima, poznatim kao kinaze. Rad utire put za nove pristupe proučavanju molekularnih pokretača bolesnih stanja kao što je rak.
Istraživanje – „CDK6 aktivnost u ponavljajućem motivu konvergentne kinazne mreže“, autora Christine Gangemi, Rahkesh Sabapathi i Haralda Janovjaka – objavljeno je u časopisu Federation of American Societi for Experimental Biology Journal (The FASEB Journal).
Kinaze su specifična porodica proteina koji dodaju fosfate drugim molekulima – proces koji se naziva fosforilacija, koji može promeniti funkciju njihovih supstrata (ciljnih proteina). Kod ljudi, više od 500 kinaza fosforiliše oko 15% svih proteina. Međutim, više od jedne kinaze može fosforilizovati isti supstrat, a to se može desiti na istim ili različitim mestima. Ovo je poznato kao konvergencija i često može otežati proučavanje specifične kinaze ili supstrata, jer aktivnost više kinaza može ometati analizu.
Razumevanje kompleksne kinazne mreže je važno, jer disregulacija ovih proteina može dovesti do bolesti, kao što je preživljavanje i širenje ćelija raka ili njihova otpornost na terapiju.
Dok je većina istraživanja kinaze imala tendenciju da se fokusira na karakterizaciju fosforilacionih mreža između kinaza i njihovih supstrata, istraživači u laboratoriji Janovjak na Medicinskom fakultetu i javnom zdravlju Univerziteta Flinders zauzeli su drugačiji pristup analizirajući koliko je uobičajena konvergencija u svim ljudskim kinazama i koristeći ove uvide da ga eksperimentalno seciraju.
Jedan primer su blisko povezane ciklin zavisne kinaze 4 i 6 (CDK4/6).
„Mnoge kinaze, posebno proteini ćelijskog ciklusa kao što je CDK4/6, pokretači su proliferacije ćelija raka i otpornosti na lekove. Naš cilj je bio da pronađemo nove puteve za njihovo efikasnije proučavanje, kao i da analiziramo i analiziramo konvergenciju svih ljudskih kinaza“, kaže Kristina Gangemi, istraživač-saradnik na Institutu za zdravstvena i medicinska istraživanja Flinders.
Istraživači su prvo koristili računarske pristupe za kvantifikaciju i mapiranje konvergentnih odnosa kinaze i supstrata (cKSR). Rezultati su otkrili da su cKSR uobičajeni i da uključuju više od 80% svih humanih kinaza i više od 24% svih supstrata. Konvergencija je takođe široko rasprostranjena kada više od jedne kinaze fosforiliše isto mesto na supstratu (cKSR-ovi specifični za mesto).
Istraživanje je takođe identifikovalo signalne puteve gde se javljaju recipročne petlje fosforilacije, kada supstrat kinaze može da fosforiliše tu kinazu. Zanimljivo je da oko polovine ovih interakcija nije prethodno opisano.
Analiza koekspresije je otkrila da se cKSR često eksprimiraju u istom tipu ćelije. Na primer, konvergentne serin/treonin kinaze su koeksprimirane u više od 70% analiziranih humanih ćelijskih linija u studiji.
Istraživači su uzeli ove nove uvide da bi secirali prototipski par konvergentne kinaze, CDK4/6, koji su usko povezani članovi porodice koji fosforilišu protein retinoblastoma (RB) i dele mesta fosforilacije koja se preklapaju.
U većini konteksta, prisustvo ili CDK4 ili CDK6 je dovoljno da fosforiliše RB do nivoa koji zabranjuje analizu aktivnosti druge kinaze. Takođe, postoje CDK4/6 inhibitori, ali nisu specifični samo za CDK6 ili CDK4, što ih čini tehnički teškim za pojedinačno proučavanje. Istraživači su prvo prekomerno eksprimirali CDK6 u ćelijskoj liniji raka dojke da bi videli da li se može otkriti njegov efekat na fosforilaciju RB.
„Otkrili smo da jednostavna prekomerna ekspresija CDK6 u ovim ćelijama nije dovoljna za otkrivanje njegove aktivnosti, pošto je RB već visoko fosforilisan od strane CDK4, tako da smo morali da preduzmemo alternativni pristup“, kaže gospođa Gangemi.
Upotrebljen je dodatak CDK4/6 inhibitora za koji je ranije pokazano da pokreće otpornost na inhibitore posredovane CDK6 u ćelijama raka dojke. Prekomerna ekspresija CDK6 u kombinaciji sa tretmanom inhibitorima rezultirala je otkrivanjem CDK6 zavisne fosforilacije RB.
Test se može koristiti u nizu svrha kao što je razumevanje efekta proteinskih modulatora na funkciju CDK6, testiranje projektovanih verzija kinaze ili proučavanje efekata mutacija koje mogu biti uključene u izazivanje bolesti.
„Uporedo sa razvojem novog testa za proučavanje CDK6, računarska analiza koju smo izvršili ima potencijal da secira druge cKSR. Ovaj rad pruža nove mogućnosti za eksperimentalno prevazilaženje konvergencije sa kinazama i mogao bi nas pokrenuti ka dubljem razumevanju kinaznih mreža i funkcija“, kaže Gangemi.
