Nova tehnika za testiranje funkcije trombocita u uzorku krvi osobe je brža, lakša i preciznija od metoda koje se trenutno koriste, pokazuje eksperimentalna studija.
Nature Biomedical Engineering objavio je istraživanje koje su vodili naučnici sa Univerziteta Emori.
Istraživači su demonstrirali dokaz koncepta za tehniku, koji pruža prvi detaljan pogled na molekularne sile koje stvaraju aktivirani trombociti u uzorcima krvi pacijenata.
Rezultati studije pokazuju da tehnologija ima potencijal da proceni efekte antitrombocitnih lekova na pojedince i da dobije jasniju sliku rizika od krvarenja kod pacijenata koji su podvrgnuti operaciji kardiopulmonalne bajpasa.
Tehnika zahteva samo oko kap krvi za pokretanje testova, u poređenju sa supenom kašikom potrebnom za trenutne testove. Ova ultraosetljivost može učiniti tehnologiju vrednim alatom za dijagnozu beba koje pate od retkih, urođenih poremećaja trombocita.
Ovo otkriće je zasnovano na sintetičkim DNK sondama za napetost razvijenim pre više od jedne decenije u laboratoriji Khalida Salaite, profesora na Emorijevom odeljenju za hemiju i na odeljenju za biomedicinsko inženjerstvo Vallace H. Coulter-a na Emori and Georgia Tech.
Sonde za zatezanje mogu otkriti ćelijske sile veličine samo nekoliko pikonjutona, ili oko milijardu puta manje od težine spajalice. Istraživači su pronašli način da pojačaju signal sondi tako što će iskoristiti snagu enzima poznatog kao 12a povezan sa CRISPR-om. Mehanički signal se zatim detektuje pomoću čitača ploča, alata koji se rutinski koristi u kliničkom testiranju.
„Ovaj projekat je započeo iz osnovne radoznalosti“, kaže Salaita, ko-korespondentni autor. „Želeli smo da znamo da li možemo da izmerimo najsitnije sile koje vrše ćelije. Uzbudljivo je što sada gradimo na ovoj osnovnoj radoznalosti kako bismo razvili dijagnostičke alate za pomoć pacijentima. To je san naučnika.“
Prvi autor rada je Iukin Duan, postdoktorski saradnik Američkog udruženja za srce u laboratoriji Salaita.
Roman Sniecinski, profesor na Katedri za anesteziologiju Medicinskog fakulteta Emori i vodeći stručnjak u oblasti perioperativne koagulacije, je ko-korespondentni autor rada.
„Funkcija trombocita je generalno važna, a ipak su trenutni alati koje imamo da je izmerimo relativno primitivni“, kaže Sniecinski. „Ova nova tehnika nudi lakši, brži i jeftiniji način merenja funkcije trombocita, a istovremeno nam pruža ključne informacije koje ranije nismo imali.“
Trombociti su bezbojni fragmenti krvnih zrnaca u obliku diska čiji je zadatak da se vežu na mestu povređenog krvnog suda kako bi zaustavili krvarenje. U nekim slučajevima, međutim, trombociti možda neće funkcionisati optimalno. Kada su trombociti slabi ili manje aktivni od optimalnog, krv se možda neće pravilno zgrušati, što dovodi do nekontrolisanog krvarenja. Ali ako su trombociti „hiperaktivni“, mogu postati previše lepljivi i izazvati spontane krvne ugruške koji mogu dovesti do srčanog ili moždanog udara.
Regulisanje funkcije trombocita je posebno kritično za ljude sa većim rizikom od nekih stanja. Antiagregacioni lekovi, kao što su klopidogrel, tikagrelor, pa čak i aspirin, spadaju među najčešće propisane lekove u Sjedinjenim Državama. Kod nekih pacijenata, međutim, ovi lekovi možda neće dobro funkcionisati, a prilagođavanje doza ili prelazak na drugi lek može bolje pomoći u sprečavanju srčanih udara.
Tokom kardiohirurgije, funkcija trombocita postaje još više disregulisana. Tim u operacionoj sali mora da izvrši balansiranje tako da se krv ne zgruša tokom kardiopulmonalnog bajpasa, zatim da koristi prokoagulantne intervencije, uključujući transfuziju trombocita, da zaustavi krvarenje kada se hirurški zahvat završi. Ovo može biti teško jer upotreba mašine za kardiopulmonalni bajpas može stresti i oslabiti krvne pločice.
„Decenijama su ljudi pisali u naučnoj literaturi o ovom problemu disfunkcije trombocita tokom kardiohirurgije“, kaže Sniecinski, „ali to je zaista teško izmeriti pomoću alata koje koristimo. A otkako nismo bili sposoban da dobro izmeri funkciju trombocita, to je otežavalo njegovo efikasno proučavanje.“
Agregometrija je standardni alat koji se trenutno koristi za procenu funkcije trombocita. Meri brzinu i stepen u kome se trombociti u uzorku krvi skupljaju ili agregiraju.
„Ovi podaci pružaju samo mali deo slike funkcije trombocita, i to nije najzanimljiviji deo“, kaže Sniecinski.
Kada se trombocit aktivira, objašnjava on, menja svoju morfologiju i izrasta u male pseudo „ruke“. Trombociti koriste ove krakove da bi se uhvatili za lance proteina u krvi zvanih fibrinogen da bi formirali ugruške.
„Agregometrija vam govori da se trombociti skupljaju zajedno“, kaže Sniecinski. „Ali to vam ne govori o njihovom nivou aktivacije – količini sile koju koriste da se drže drugih proteina koagulacije, kao i jedni drugih.“
Laboratorija Salaita je lider u vizuelizaciji i merenju mehaničkih sila koje primenjuju ćelije koristeći sonde za napetost napravljene od sintetičkih niti dvolančane DNK vezane za površinu.
Dvostruki lanci DNK se mogu programirati da se vežu za ćelije trombocita. Kada se ćelije vežu i primenjuju silu na usidrenu DNK, DNK se deli na dva lanca, ostavljajući jedan lanac zaglavljen za površinu. Dobijeni fizički potez se pretvara u fluorescentni signal.
Međutim, veliki izazov za čitanje ovog signala je to što su ovi fizički potezi slabi, prolazni i retki. Za njihovo otkrivanje potreban im je mikroskop.
Tokom pandemije COVID-19, enzim CRISPR 12a, ili Cas12a, došao je do izražaja kao dijagnostički alat za virus SARS-CoV-2. Bakterije koriste Cas12a za odbranu od faga ili virusa koji napadaju bakterije. Enzim Cas12a može biti napunjen jednolančanom „vodičom“ RNK koja je programirana da se veže za komplementarnu jednolančanu DNK. Enzim zatim reaguje na jednolančanu DNK uništavanjem druge jednolančane DNK koja je okružuje.
Laboratorija Salaita odlučila je da kombinuje Cas12a sa svojim tenzionim sondama da vidi da li će enzim pojačati signal za mehaničke sile koje vrše trombociti. Laboratorija je razvila ono što naziva Mechano-Cas12a senzor zategnutosti ili MCATS.
„Radilo je kao gangbusteri“, kaže Salaita.
„Cas12a je tih i neaktivan ako ne vidi svoju metu“, objašnjava on. „Ali čim ugleda specifičnu jednolančanu DNK, postaje banane i počinje da uništava bilo koju jednolančanu DNK na koju naiđe. Ova aktivacija generiše masivni izlaz fluorescentnog signala.“
MCATS je precizan i ultraosetljiv, sposoban da meri ćelijske vučne sile koje generiše samo 2.000 trombocita u uzorku. Dobijeni signal je dovoljno robustan da se meri pomoću konvencionalnog fluorometra — alata koji se obično koristi u rutinskim testovima krvi.
MCATS takođe radi sa čitačem ploča, instrumentom dizajniranim da istovremeno obrađuje desetine uzoraka, za vrstu očitavanja velike propusnosti koja je potrebna za sprovođenje istraživanja.
Da bi testirali efikasnost MCATS-a u merenju aktivnosti trombocita, istraživači su uzeli uzorke krvi od zdravih dobrovoljnih davalaca. Prvo su potvrdili da je MCATS odgovor osetljiv na mehaničke sile trombocita.
Zatim su zdravim uzorcima krvi dodali različite lekove protiv trombocita, u rasponu od aspirina bez recepta do panela različitih lekova na recept. Rezultati MCATS-a su pokazali da su antitrombocitne terapije smanjile mehaničku aktivnost trombocita za količinu sličnu redukciji uočenoj u agregometriji.
Istraživači su takođe dobili dozvolu da uzmu uzorke krvi za ispitivanje od sedam pacijenata pre i posle kardiopulmonalne bajpas operacije. Rezultati su pokazali da su MCATS očitavanja za aktivnost trombocita uzorka svakog pojedinačnog pacijenta u korelaciji sa njihovom verovatnoćom da će im biti potrebna transfuzija trombocita kako bi se minimiziralo krvarenje nakon operacije.
Istraživači sada upisuju učesnike u prospektivnu studiju kako bi dalje istražili MCATS kao dijagnostički alat. Ljudima kojima je dijagnostikovan poremećaj trombocita biće testirani uzorci krvi pre i posle tretmana kako bi se procenilo koliko dobro terapija funkcioniše.
„Suština je da je MCATS potpuno novi način merenja funkcije trombocita koristeći zaista mali uzorak“, kaže Sniecinski. „To nam govori nešto specifično što ranije nismo mogli da izmerimo, a to nam može dati novi način da razumemo šta se dešava sa disfunkcijom trombocita i najbolje metode za kontrolu.“
„Pregled krvi vam daje osnovno očitavanje vašeg zdravlja na osnovu podataka kao što su broj trombocita i metaboličke koncentracije“, dodaje Salaita. „Sada dodajemo informacije o mehanici trombocita. To je kao da imate potpuno novi brojčanik na kontrolnoj tabli za praćenje vašeg zdravlja.“
