Otkako je neuroanatomista iz 19. veka Santjago Ramon i Kajal otkrio prelepo složene neurone mozga – ono što je nazvao „misteriozni leptiri duše“ – neuronaučnici su nastojali da okarakterišu stotine ili hiljade vrsta moždanih ćelija i otkriju kako one rade. zajedno. To je uzvišen cilj, ali onaj koji bi u velikoj meri pomogao neuronaučnicima da konačno razumeju zamršenu mrežu moždanih kola – i njihovu funkciju.
U protekloj deceniji, ovo polje je dobilo dobrodošlicu od novih jednoćelijskih transkriptomskih tehnologija, koje identifikuju neurone i druge moždane ćelije merenjem razlika u obrascima ekspresije gena. Porodica tehnika zvanih prostorna transkriptomika napravila je ovo ključni korak dalje – govoreći istraživačima ne samo o identitetu i funkciji ćelije, već io tome kako se ona uklapa u složeno ožičenje mozga.
Ali prostorna transkriptomija je imala mučan problem. Mnoge različite vrste ćelija su često bliski susedi u mozgu, mešaju se i brzo dele poruke jedna sa drugom. To znači da trenutne metode prostorne transkriptomike nemaju dovoljno dobru rezoluciju da spreče mešanje gena iz obližnjih ćelija i netačnu identifikaciju tipova ćelija.
Sada, u radu objavljenom 22. juna u Nature Methods, istraživači sa Instituta za neuronauke Vu Tsai na Stanfordu pokazali su značajno poboljšanje u rezoluciji prostorne transkriptomije koristeći lukav trik. Proširujući moždano tkivo tako da je poraslo 2,5 puta u veličini, Bo Vang, docent bioinženjeringa, i njegove kolege su uspeli da uspešno razreše tipove neurona u hipokampusu i mirisnoj sijalici mišjeg mozga sa mnogo finijim detaljima nego što to standardne metode dozvoljavaju.
Vang je član Neuro-omics Initiative — Velike ideje u neuronauci — koja nastoji da izgradi nove alate za poboljšanje našeg razumevanja mozga na molekularnom nivou gena i proteina i na kraju zatvori jaz između našeg razumevanja mikroskopskih molekula do velikih moždanih kola i mreža. Nova tehnika, nazvana prostorna transkriptomika ekspanzije (skraćeno Ek-ST), predstavlja odličan primer novog alata koji će pokrenuti Inicijativu za neuro-omiku napred u ovoj misiji.
Prostorna transkriptomika se oslanja na hvatanje genetskih instrukcija zvanih mRNA iz delova tkiva. Ova uputstva za mRNA su ono što usmerava naše ćelije da naprave svoju proteinsku mašineriju, a njihovo hvatanje omogućava istraživačima da klasifikuju svaku ćeliju u većem uzorku tkiva. Problem je bio u tome što standardni nizovi za hvatanje nisu bili dovoljno gusti da uhvate mRNA iz sićušnih pojedinačnih ćelija. Umesto toga, svaka „tačka“ na nizu hvata mRNA iz preklapajućih tipova ćelija, što otežava identifikaciju pojedinačnih ćelija.
Da bi zaobišli problem, Vang i njegove kolege su zauzeli donekle kontraintuitivan pristup. Umesto da nastave višedecenijsko putovanje koje su neuronaučnici preduzeli da poboljšaju rezoluciju alata za snimanje, oni su inspirisali tehniku ekspanzione mikroskopije koju je pionir laboratorija Eda Bojdena na MIT-u. Bojdenova metoda proširuje samo moždano tkivo tako da se pod mikroskopom može posmatrati u višoj rezoluciji.
Vangov tim je odlučio da vidi da li prostorna transkriptomika može imati koristi od istog pametnog trika za proširenje tkiva. Tačnije, zaključili su da ako bi mogli da prošire ćelije, onda bi svako mesto moglo da uhvati mRNA iz manje ćelija, omogućavajući veću rezoluciju za identifikaciju različitih neurona.
Da bi se postigla ekspanzija, istraživački tim—koji je uključivao saradnju sa naučnicima iz Laboratorije Nauka za život u Stokholmu, Švedska—razvio je cevovod koji počinje sidrenjem mRNA na matricu gela. Zatim primenjuju enzime koji žvaću sve proteine u tkivu koji se ne mogu proširiti dok sve što ne preostane nije mRNA suspendovana u gelu — ono što Vang naziva „tkivo duhova“.
Ovde je tim imao koristi od drugog skupa mikroskopskih tehnika koje je razvio profesor sa Stanforda Karl Deisseroth. Pričvršćivanjem tkiva za gel, a zatim uklanjanjem molekula koji raspršuju svetlost, ove tehnike „jasnoće“ čine moždano tkivo gotovo čistim kao staklo.
„Tkivo duhova“ u gelu se brzo proširilo kada se stavi u vodu (zahvaljujući efektima elektrostatičkog odbijanja). Sve u svemu, nabujao je oko 2,5 puta u sve tri dimenzije.
Ali impresivan rast je takođe doveo do gubitka mRNK, ostavljajući minimalne količine za hvatanje. Bio je to neverovatno izazovan projekat, sa dva tima koja su radila širom sveta tokom pandemije.
„Neko vreme, mislio sam, nikada neće uspeti. Kao da smo zašli u ćorsokak“, rekao je Vang. Ali Vang odaje priznanje dvojici diplomiranih studenata koji su vodili projekat — Iuhangu Fanu u njegovoj laboratoriji i Žaneti Andrusivovoj u Švedskoj — što su istrajali i na kraju pronašli podešavanja koja su omogućila da metod funkcioniše. „Ono što smatram zadivljujućim je da ih nisu obeshrabrili svi neuspesi“, rekao je on.
Na kraju se mukotrpan put isplatio. Istraživači su uspeli da potvrde da je Ek-ST bolji u rešavanju tipova neurona u hipokampusu i olfaktornoj sijalici. Na primer, gledajući neurone u CA1 regionu hipokampusa, koji su ključni za učenje i pamćenje, povećana rezolucija je značila da su bili u stanju da razlikuju mRNK prisutnu u veoma dugim dendritima nalik na antenu ćelija u odnosu na kompaktnija ćelijska tela. Dakle, Ek-ST pruža novi prozor u aktivnost gena koja se dešava na različitim mestima unutar pojedinačnih neurona.
Vang se nada da će njihova nova Ek-ST metoda odmah imati uticaja na hiljade neuronaučnika širom sveta koji već koriste ove metode. „Mogli bi imati koristi od naše metode jer je to samo mala modifikacija njihovih protokola, tako da bukvalno mogu samo da ponove svoje eksperimente i značajno poboljšaju svoje rezultate“, rekao je Vang.
Kada je Likun Luo, profesor biologije i koautor rada, prvi put video uspeh Ek-ST metode, bio je uzbuđen što se tako jednostavna, ali pametna ideja pokazala tako efikasnom. „Kombinuje dve najsavremenije tehnologije, ekspanzionu mikroskopiju i prostornu transkriptomiku, kako bi omogućio profilisanje ekspresije gena u moždanom tkivu sa neverovatnom – sve do jedne ćelije – rezolucijom“, rekao je on.
Luo je takođe vodeći istraživač Inicijative Neuro-omics, i napominje da je uzbuđen što sada ima Ek-ST metodu. „Glavna komponenta Neuro-omike je primena najsavremenijih jednoćelijskih transkriptomskih tehnologija za rešavanje tipova neuronskih ćelija“, rekao je Luo. „Sada, Ek-ST omogućava takvu analizu sa mnogo poboljšanom rezolucijom, što postavlja važnu osnovu za razumevanje strukture i funkcije moždanog tkiva.“
Čak i uz velika poboljšanja, istraživački tim i dalje ima za cilj da još više poveća rezoluciju. Trenutno napreduju ka razvoju metode koja može dešifrovati specifične podtipove mRNK, poput onih sa određenim modifikacijama. To je zadatak koji postaje moguć samo zbog njihovog pionirskog rada na povećanju efikasnosti prostorne transkriptomike.
U skladu sa ciljevima Inicijative Neuro-omics, Vangov tim ide u ovom pravcu jer će otkriti više o tome kako funkcionišu najsitniji delovi mozga. Oni ne koriste samo obrasce mRNA da bi razlikovali različite tipove ćelija – oni takođe žele da znaju šta ove različite genetske poruke znače za funkciju ćelije. „Tamo idemo jer mislimo da nam to može dati više informacija o tome šta moždane ćelije zaista rade.“
