Mejotska rekombinacija generiše genetsku raznolikost i promoviše pravilnu hromozomsku segregaciju roditeljskih hromozoma. Ovaj proces zahteva skup rekombinaza polimerizovanih na jednolančanim (ss) DNK zvanim nukleoproteinski filament da bi se podvrgli traženju homologije i razmeni lanaca između homolognih DNK.
U mejozi Saccharomices cerevisiae, programirani dvolančani prekidi DNK (DSB) se formiraju pomoću Spo11 da bi se generisali 3′-ssDNK repovi. Jednom formirani, ssDNK previsi se brzo vezuju za obilni protein koji vezuje ssDNK visokog afiniteta, protein za replikaciju A (RPA), da zaštiti ove ssDNK od nukleolitičke degradacije ili formiranja struktura DNK višeg reda.
SsDNK supstrati obloženi RPA se razlikuju od golih ssDNK supstrata zbog visokog afiniteta RPA za ssDNK; stoga, rekombinacioni medijator Mei5-Sae3 proteinski kompleks je neophodan za vezivanje rekombinaza na ssDNK obloženu RPA. Međutim, mehanička uloga Mei5-Sae3 u posredovanju aktivnosti Dmc1 ostaje nejasna.
Da bi istražio kako Mei5-Sae3 stimuliše Dmc1 da istisne RPA i formira nukleoproteinske filamente, istraživački tim, iz NTU hemije, NTU IBS i Univerziteta u Osaki, koristio je tehnike biohemijskog prečišćavanja proteina i FRET sa jednim molekulom i kolokalizaciju Single-Molecule Spectroscopi (spektroskopija sa jednim molekulom) tehnike za hvatanje vezivanja Dmc1 u realnom vremenu i disocijacije RPA na individualnoj DNK sa izuzetnom vremenskom rezolucijom.
Njihovi rezultati su objavljeni u časopisu Istraživanje nukleinskih kiselina.
Za razliku od tradicionalnih bioloških pristupa, koji uglavnom gledaju na konačne ravnotežne proizvode ansambl reakcija, metode sa jednim molekulom mogu da razjasne doprinose pojedinačnih biohemijskih koraka iz pojedinačnih molekula, otkrivajući prolazna međustanja koja bi mogla dati uvid u to kako reakcija napreduje.
Rezultat je pokazao da je Mei5-Sae3 stabilizovao Dmc1 nukleirajuće klastere sa 2-3 molekula na goloj DNK preferencijalno smanjujući stope disocijacije Dmc1. Mei5-Sae3 je takođe stimulisao sklapanje Dmc1 na DNK obloženoj RPA.
Korišćenjem RPA obeleženog GFP-a, primećena je koegzistencija intermedijera sa Dmc1 i RPA na ssDNK pre disocijacije RPA. Štaviše, efikasnost pomeranja RPA zavisila je od koncentracije Dmc1, a njena zavisnost je bila u pozitivnoj korelaciji sa stabilnošću Dmc1 klastera na kratkoj ssDNK.
Ovi nalazi sugerišu molekularni model da Mei5-Sae3 posreduje u vezivanju Dmc1 na ssDNK obloženoj RPA stabilizacijom klastera Dmc1 jezgara, čime se utiče na dinamiku RPA na DNK kako bi se promovisala disocijacija RPA.
Istraživanje doprinosi prvom ikada objavljenom detaljnom molekularnom modelu za ovaj jedinstveni protein medijator Mei5-Sae3, objašnjavajući kako interakcija medijator-rekombinaza može stimulisati sklapanje rekombinaze na ssDNK obloženoj RPA.
