Studija je identifikovala genetsku mutaciju koja leži u osnovi retkog oblika epilepsije i otkriva nove molekularne i ćelijske mehanizme pomoću kojih se poremećaj manifestuje kod pacijenata.
Istraživanje, koje je danas objavljeno kao Pregledani preprint u eLife-u, urednici opisuju kao fundamentalni značaj jer značajno unapređuje naše razumevanje KCNK2 encefalopatije. Oni opisuju korišćene metode kao najsavremenije, pružajući ubedljivu snagu dokaza.
„KCNK2 encefalopatija je redak neurorazvojni poremećaj uzrokovan varijantama gena KCNK2, koji daje recept za vrstu moždanog kalijumovog kanala“, objašnjava glavni autor Timoti Abreo, student postdiplomskog programa za genetiku i genomiku na Medicinskom koledžu Bejlor, Hjuston, Teksas, SAD. „Poremećaj se obično manifestuje kao napadi koji počinju nekoliko dana nakon rođenja i kašnjenja u razvoju koja su doživotna i bez efikasnog trenutnog lečenja.“
Novo identifikovane varijante u genu KCNK2 teško je proceniti, jer nije svaka varijanta uzrok bolesti, a razlozi zbog kojih neke varijante dovode do bolesti su slabo shvaćeni.
Studija istraživačkog tima počela je kada je žensko dete, rođeno u SAD, doživelo epileptične napade koji su se ponavljali tokom prvog meseca života. Genetsko testiranje je otkrilo jednu promenu aminokiseline — glicin 256 promenjen u triptofan (G256V) — na jednoj kopiji gena KCNK2, koji je ranije bio nepoznat i klasifikovan kao neizvesnog kliničkog značaja.
Studija tima pažljivo je karakterisala kliničku i razvojnu istoriju mladog pacijenta. U ranom detinjstvu, zastoji u razvoju su postali očigledni, a kasnije joj je dijagnostikovan kortikalni poremećaj vida i poremećaj autističnog spektra. Sada ima 12 godina, ona je u stanju da koristi adaptivni komunikacioni uređaj da postavlja zahteve i koristi modifikovani znakovni jezik. Istraživači su pratili naučnu literaturu i kasnije pronašli tri druge osobe u Aziji i EU sa istom varijantom G256V i simptomima sličnim pacijentima iz SAD. Ova komponenta opservacijske studije omogućila je timu da specificira karakteristike koje će se modelirati u laboratoriji.
Tim je ispitao strukturu i patogenost varijante G256V koristeći molekularne, ćelijske i in vivo pristupe. Oni su modelirali strukturne posledice varijante G256V na osnovu prijavljenih struktura krio-elektronske mikroskopije KCNK2 kanala i drugih sličnih proteina kanala.
Kao i drugi kalijumovi kanali, KCNK2 sadrži tri kritična regiona: kupolu, spiralu pora i filter selektivnosti. Varijante koje izazivaju bolest imaju tendenciju da leže u ostacima u blizini filtera selektivnosti, zbog njegove ključne uloge koja omogućava protok jona. Međutim, aminokiselina G256 leži relativno daleko od filtera selektivnosti, što bi obično ukazivalo na to da je manja verovatnoća da će varijanta izazvati bolest.
Tim je otkrio dokaze da G256 pomaže u formiranju mreže vodoničnih veza koje služe za stabilizaciju strukture regiona koji formira pore. Ovo je dalo novu hipotezu zašto bi mutacija aminokiselina tako udaljena od filtera selektivnosti mogla biti patogena.
Zatim su Abreo i kolege izveli niz eksperimenata u kojima su uveli varijantu G256V u ćelije uz normalne KCNK2 i KCNK3 gene. Oni su merili električnu aktivnost u ćelijama i primetili da prisustvo varijante G256V potiskuje funkciju normalnog gena i smanjuje jonsku struju koju stvaraju ćelije.
Konačno, koristili su tehnike za uređivanje gena Crispr/Cas9 i generisali miševe koji nose istu varijantu G256V. Miševi sa G256V pokazali su promene u distribuciji proteina KCNK2 i KCNK3 u mozgu, posebno u regionu zvanom hipokampus koji igra bitnu ulogu u učenju i pamćenju. Otkrili su da su u modelima miševa proteini KCNK2 i KCNK3 pomereni sa svoje uobičajene lokacije u početnim segmentima aksona u neuronske somate.
Drugi eksperimenti su pokazali da su nivoi proteina KCNK2 smanjeni za otprilike 50%, a neuroni u CA1 regionu hipokampusa pokazali su povećanu ekscitabilnost, što potencijalno ukazuje na veću podložnost napadima. Zaista, novorođenčad i stariji G256V miševi imali su spontane napade koji su doveli do prerane smrtnosti koja nije primećena kod kontrolnih miševa.
„Uzeto zajedno, naša studija otkriva da prisustvo KCNK2 G256V varijanti utiče i na molekularne i na ćelijske aspekte aktivnosti KCNK kanala, uključujući njihov kapacitet za nošenje jona, ekspresiju i postavljanje unutar ćelija“, objašnjava stariji autor Edvard Kuper, vanredni profesor neurologije. , neuronauka i molekularna i ljudska genetika na Medicinskom koledžu Bejlor. „Ove promene verovatno kombinuju da pokreću patogenost varijante i njene kliničke simptome.“
„Naši rezultati mogu biti široko primenljivi jer većina pacijenata sa KCNK2 encefalopatijom deli varijante u blizini filtera selektivnosti“, dodaje Abreo.
Roditelji američkog deteta, koji su takođe koautori rada, igrali su ključnu, 10 godina dugu ulogu u studiji, deleći svoju istoriju, podstičući kontakt između kliničara i laboratorijskih naučnika i pomažući dr Kuperu da izgradi multiinstitucionalnu laboratorijski tim koji je generisao i analizirao miševe.
„Kao roditelji i lideri fondacije koju vode roditelji i koja predstavlja globalne uticaje KCNK2, uzbuđeni smo što vidimo da ove studije otkrivaju nove misterije poremećaja. Takav napredak je put ka boljim ishodima pacijenata i preciznim medicinskim terapijama“, rekao je Jim Johnson, otac pogođenog deteta u SAD i predsednik KCNK2 Cure Alliance*.
Autori podstiču dalja istraživanja u ovoj oblasti kako bi proširili svoje nalaze. Posebno ističu da, iako miševi sa varijantom G256V pokazuju spontane konvulzivne napade i smrtne slučajeve povezane sa napadima, oni ne pokazuju vrlo rani početak i visoku učestalost uočena kod ljudi sa istom varijantom.
„Ova razlika zaslužuje više istrage“, napisali su. Pored toga, „selektivni otvarači KCNK2, koji se suprotstavljaju efektima G256V in vitro kao što je prikazano u našoj studiji, treba da se testiraju na mutantnim životinjama i ako su efikasni, na ljudima sa varijantama koje izazivaju KCNK2 bolesti“, kaže dr Kuper.
