Istraživači Stanford Medicine i njihove kolege pregledali su gomilu gena koji su umešani u neurorazvojne poremećaje i identifikovali desetine različitih uzročnika problema sa sličnim efektima.
Pošto metoda koju su koristili sortira defektne gene prema njihovoj funkciji – ili u ovom slučaju, njihovoj disfunkciji – pristup će verovatno ubrzati razvoj lekova za neurorazvojne poremećaje.
Studije su uključile najmanje 500 gena u takve poremećaje. Ali naučnici nemaju pojma kako tačno defekti u većini ovih gena narušavaju funkciju mozga.
Istraživanje, koje ukazuje na put ka stvaranju reda iz ovog haosa, opisano je u radu objavljenom 27. septembra u časopisu Nature. Sergiu Pasca, MD, Kenneth T. Norris, Jr. Profesor II psihijatrije i bihevioralnih nauka, je stariji autor studije. Glavni autor je Ksiangling Meng, Ph.D., postdoktorski stipendista u Pascinoj grupi.
Postoje dve glavne klase neurona u cerebralnom korteksu: ekscitatorni i inhibitorni. Ekscitatorni neuroni ispaljuju impulse koji aktiviraju druge neurone, dok aktiviranje inhibitornih neurona blokira druge neurone da se aktiviraju. Inhibitorni i ekscitatorni neuroni se integrišu da formiraju kola, oblikujući signalnu aktivnost u mozgu.
Kod ljudi, čak polovina svih ćelija u moždanoj kori, najudaljenijem i najskorije razvijenom sloju mozga, je inhibitorna. Naučnici teoretiziraju da bi neravnoteža u broju ili funkciji inhibitornih neurona u poređenju sa ekscitatornim neuronima mogla biti barem delimično odgovorna za poremećaj autističnog spektra i epilepsiju.
„Ako je to tačno, mogli biste pronaći načine da promenite funkcionalnu ravnotežu ovih ćelija u korteksu kao terapijski pristup za ove poremećaje“, rekao je Pasca. Ali prvo, pitao se, kako razumeti ogromnu kolekciju gena koji su umešani u ove uslove, ali čiji su uticaji uglavnom nepoznati?
Da li postojanje stotina gena povezanih sa bolešću znači da postoje stotine različitih tipova neurorazvojnih poremećaja, od kojih svaki zahteva drugačiji lek? Ili bi se nekoliko različitih gena moglo konvergirati i dovesti do slične patologije ili nekog njenog posebnog aspekta?
„Ako je ovo drugo, grupa genskih defekata koji svi proizvode sličan fiziološki deficit mogla bi biti podložna jednoj vrsti lečenja“, rekao je Pasca.
Do nedavno, nije bilo načina da se proučava rani razvoj mozga kod čoveka. Ali Pasca, koja je takođe Boni Ujtengsu i direktor porodice u Stenfordskom programu organogeneze mozga, uvela je tehnologiju koja omogućava detaljno istraživanje ljudskog mozga u razvoju.
Sa specijalnim laboratorijskim staklenim posuđem; kombinacija faktora rasta (supstanci koje stimulišu rast ćelija) i hranljivih materija; i ljudskim indukovanim pluripotentnim matičnim ćelijama — ili iPS ćelijama, koje se mogu generisati iz jednostavne biopsije kože — on može da generiše male nakupine nervnog tkiva čija anatomska arhitektura i funkcija veoma podsećaju na deo mozga, kao što je moždana kora čoveka. Pasca ove nakupine naziva kortikalnim organoidima.
Prilagođavanje hranljivih sastojaka i faktora rasta u kojima se iPS ćelije kupaju, pokazao je Pasca, generiše organoide koji se približavaju drugoj strukturi mozga koja se zove subpalijum. Smešten dublje u prednjem mozgu od korteksa, subpalijum igra ključnu ulogu tokom fetalnog i infantilnog razvoja: proizvodi inhibitorne neurone, poznate kao interneuroni, koji migriraju u korteks i drugde i spajaju se sa ekscitatornim neuronima da formiraju funkcionalna kola sposobna za kompleksno generisanje signala.
Postavljanjem subpalijalnih organoida pored kortikalnih organoida i čekanjem nekoliko dana, Pasca je po prvi put bio u mogućnosti da posmatra kako se ove dve strukture stapaju zajedno da formiraju ono što on naziva „asambloidi“ i da posmatra interneurone kako migriraju iz subpalijuma u korteks i povežite se sa ekscitatornim neuronima tamo.
U novoj studiji, Pasca i njegove kolege su uparili ovu najsavremeniju tehnologiju sa drugom: CRISPR.
CRISPR koristi molekularne makaze i molekularnog krvoslednika. Ovo omogućava istraživačima da po volji izdvoje specifične sekvence DNK, tako da mogu da izbace odabrane gene iz genoma i vide šta će se desiti.
Pasca i njegove kolege suzili su 661 gen povezan sa neurorazvojnim poremećajima na svojoj listi na 425 koji se aktiviraju u interneuronima. Stvorili su iPS ćelije koje kada se diferenciraju u višećelijske organoide fluoresciraju samo u onim ćelijama koje su postale interneuroni. Na ovaj način, mogli bi da generišu subpalijske organoide u kojima bi mogli da razlikuju interneurone od svih drugih tipova moždanih ćelija koje subpalijum proizvodi.
Inficirali su hiljade ovih ćelija—koje su takođe bioinžinjering da nose gen čiji su proteinski proizvod bile molekularne makaze CRISPR-a—sa CRISPR „krvavima“: malim trakama nukleinskih kiselina koje su komplementarne delovima jednog ili drugog od 425 neurorazvojnih -geni povezani sa poremećajem od interesa. Gde god se takva traka pričvrstila za gen, CRISPR „makaze“, enzim, bi izrezale DNK vezanu trakom.
Bacanje dovoljno ovih pasa u dovoljno veliku grupu ovih ćelija učinilo je statistički verovatnim da će svaki od 425 sumnjivih gena biti iseckan u najmanje stotinama ćelija u bazenu.
Iz tih iPS ćelija, istraživači su generisali subpalijske organoide. Neki nisu pokazali fluorescenciju posle 44 dana u posudi, što ukazuje na njihov neuspeh da generišu interneurone. Sekvenciranjem genoma ovih organoida, istraživači su mogli da kažu koji gen je bio onemogućen CRISPR makazama, što je rezultiralo defektnom generacijom interneurona. Identifikovali su 13 takvih gena.
Da bi pronašao gene koji utiču na migraciju interneurona, Paskin tim je postavio subpalijske organoide sposobne da generišu interneurone pored zdravih kortikalnih organoida u brojnim laboratorijskim posudama. Dve vrste organoida u svakoj posudi su se spojile da bi formirale sklopoide.
Posle oko 30 dana kohabitacije organoida, istraživači su izvukli oko 1.000 asambloida iz različitih posuda i isekli svaki od njih na spoju fuzije. Zatim su uporedili fluorescentne interneurone u subpalijalnom delu svakog asambloida sa onima koji su prešli ciljnu liniju u kortikalni odeljak tog sklopoida.
Sekvenciranjem genoma ćelija, naučnici su mogli da odrede gene u kojima je ciljano brisanje poremetilo migraciju. Pronašli su ih 33.
„Identifikacija 46 gena – više od 10% svih poznatih gena povezanih sa neurorazvojnim poremećajima – čija disfunkcija narušava razvoj interneurona ukazuje na podgrupu neurorazvojnih poremećaja koje karakteriše neadekvatna inhibicija ekscitatornih kortikalnih neurona“, rekao je Pasca.
Neki od ovih gena su ranije bili neokarakterisani, a njihova funkcija nije bila sumnjiva, rekao je Pasca.
Ali drugi geni su identifikovani u drugim studijama. „Ovo je bio faktor udobnosti“, rekao je Pasca. „To je značilo da nismo ludi – ovaj pristup funkcioniše.“
Istraživači sa Kalifornijskog univerziteta u San Francisku dali su doprinos radu.
