Zajednički timski napor predvođen dr. Haruhisa Inoue (profesor, Odeljenje za rast i diferencijaciju ćelija, CiRA) uspostavio je iPS ćelije od dva pacijenta sa retinalnim distrofijama povezanim sa EIS (EIS-RD) i pretvorio ih u organoide mrežnjače za proučavanje korena uzrok ove iscrpljujuće smetnje vida. Studija je objavljena u JCI Insight.
Nasleđene retinalne distrofije (IRD) predstavljaju kolekciju degenerativnih očnih patologija koje utiču na ćelije fotoreceptora u retini, što na kraju može dovesti do nepovratnog gubitka vida. IRD je vodeći uzrok oštećenja vida i slepila, koji pogađa više od 4,5 miliona ljudi širom sveta, a poznato je da je uzrokovan mutacijama u više od 250 gena.
Mutacije u genu homologa zatvorenih očiju (EIS) su glavni faktor koji doprinosi slučajevima IRD-a. Međutim, mnogi preovlađujući životinjski modeli koji se koriste za modeliranje bolesti nedostaju ili imaju poremećenu verziju EIS gena u svojim genomima, što čini izazovnim modeliranje bolesti kod sisara.
Kroz studije zebrice, opisano je da EIS igra ključnu ulogu u održavanju morfološke strukture fotoreceptora i regulisanju transporta proteina do spoljašnjih segmenata fotoreceptorskih ćelija.
Bez obzira na to, ostaje nejasno da li su takve poremećene funkcije kod pacijenata sa IRD odgovorne za bolest i da li je poremećaj takvih bioloških procesa odgovoran za patogenezu IRD. Stoga postoji potreba da se stvore novi eksperimentalni modeli koristeći ljudske ćelije da bi se razumela bolest i osmislili potencijalni tretmani.
U tom cilju, istraživački tim je izveo iPS ćelije od dva nepovezana EIS-RD pacijenta sa istom mutacijom u EIS genu i generisao retinalne organoide da bi ih uporedio sa onima napravljenim od zdravih iPS ćelija da bi modelirao bolest.
Inicijalna morfološka, histološka (imunofluorescentna i elektronska mikroskopija) i molekularna (sekvenciranje RNK u jednoj ćeliji) analiza EIS-RD retinalnih organoida sugeriše da EIS mutacija nije uticala na razvoj retine tako da su svi tipovi ćelija bili prisutni i svi subćelijski odeljci prisutni u fotoreceptorskim ćelijama formiranim pravilno.
Međutim, iako mutacija nije uticala na ukupnu količinu EIS proteina, istraživački tim je primetio manje EIS proteina, posebno EIS-pozitivnih punktatnih struktura, u regionima cilija ili spoljašnjeg segmenta (OS) fotoreceptorskih ćelija u EIS-RD retinalnim organoidima .
Nasuprot tome, istraživači su ispitali subćelijsku lokalizaciju PRPH2, poznatog OS markera, kako bi otkrili da na njega nije uticala mutacija EIS, što sugeriše da se PRPH2 transportuje u OS pomoću mehanizma nezavisnog od EIS.
Pošto su EIS i GRK7, protein uključen u završetak i oporavak fotoodgovora, oba OS proteina koji se pretežno eksprimiraju u ćelijama konusa (u poređenju sa ćelijama štapića) i dele sličnu evolucionu istoriju (oba izgubljena kod nekih vrsta sisara), ova dva proteini mogu biti funkcionalno povezani.
Zanimljivo je da su istraživači primetili da je GRK7 značajno smanjen, čak i odsutan u nekim slučajevima, u OS regionu mutantnih retinalnih organoida. Nasuprot tome, otkrili su da mutacija EIS od interesa za ovu studiju nije uticala na interakciju proteina i proteina EIS-GRK7, što ukazuje da je defekt u subćelijskoj lokalizaciji GRK7 prvenstveno uzrokovan pogrešnom lokalizacijom EIS, a ne nemogućnošću interakcije sa GRK7 za transport do region OS.
Ekspresijom normalne verzije EIES u EIE-RD retinalnim organoidima, istraživački tim je uspešno spasio ove defekte intracelularnim transportom GRK7.
Da bi dalje potvrdio ove nalaze, istraživački tim je izbrisao EIS gen iz zdravih iPS ćelija i zebrice da bi stvorio nokaut (KO) humane iPS ćelije izvedene iz retinalnih organoida i zebrice, respektivno. Slični defekti u pogrešnoj lokalizaciji GRK7 uočeni su u oba eksperimentalna sistema, čime je potvrđena uloga EIS-a u trgovini GRK7 i gubitak funkcije uzrokovan mutacijom EIS identifikovanom kod pacijenata.
S obzirom na ulogu GRK7 u okončanju i posredovanju oporavka fotoodgovora, istraživači su se zatim fokusirali na promene izazvane svetlom u retini zebrice. U poređenju sa eis-KO zebricama koje su držane u mraku, eis-KO mutanti izloženi beloj LED svetlosti pokazali su značajno poremećenu strukturu mrežnjače, sa rasprostranjenim gubitkom fotoreceptora, koji pretežno utiču na populaciju ćelija konusa.
Ispitivanje ćelija koje prolaze kroz biološki proces koji se zove programirana ćelijska smrt, ili apoptoza, dosledno je pokazivalo povećanje umirućih ćelija u eis-KO zebri. Biohemijski test je dalje ukazao na prekomernu stimulaciju izazvanu svetlošću u odsustvu očiju, što je dovelo do povećane proizvodnje reaktivnih vrsta kiseonika koje su štetne za ćelije ako se ne razreše citoprotektivnim mehanizmima.
Istraživači su takođe otkrili da svetlosna stimulacija izaziva smrt fotoceptorskih ćelija u EIS-KO retinalnim organoidima i dalje su pokazali da je plava svetlost posebno smrtonosna.
Sve u svemu, koristeći organoide retine dobijene iz iPS ćelija i sistem modela zebrice, istraživači su identifikovali patogeni mehanizam koji leži u osnovi degeneracije mrežnjače u EIS-RD. Iako ostaje da se vidi kako se ovi nalazi mogu praktično prevesti kao preventivna nega, istraživački tim je otkrio citotoksičnost zavisnu od svetlosti, posebno plavom svetlošću visokog intenziteta, u odsustvu potpuno funkcionalnog EIS proteina, sugerišući na taj način potencijalni način za Zaštita od degeneracije mrežnjače je ograničavanje izlaganja svetlosti zatamnjenim naočarima ili drugim zaštitnim uređajima.
