Belgijski istraživači iz VIB-KULeuven Centra za mikrobiologiju i VIB-UGent Centra za biologiju biljnih sistema razvili su novi set alata od 16 različitih kratkih DNK sekvenci koje omogućavaju pokretanje kontrolisanih i specifičnih događaja rekombinacije u bilo kom genomu.
Ovaj novi patentirani paket alata, koji dopunjuje — a za određene aplikacije i prevazilazi — CRISPR, sada je dostupan istraživačima i industriji u oblasti inženjeringa genoma. Rezultati su danas objavljeni u dva istovremena rada u Nature Communications.
Rekombinaze specifične za mesto omogućavaju efikasno sečenje i lepljenje DNK na određenim lokacijama u genomu, gde svaka rekombinaza prepoznaje jednu preciznu sekvencu DNK. Zbog svoje specifičnosti za sekvencu, CRISPR sistemi su u poslednjoj deceniji zasenili rekombinaze specifične za mesto kao alat za inženjering genoma.
CRISPR sistemi su izazvali revoluciju na terenu jer se vrlo lako mogu usmjeriti na različite genomske lokuse. Međutim, pošto rekombinaze specifične za lokaciju funkcionišu drugačije, one zaobilaze neke od glavnih problema CRISPR-a, uključujući toksičnost prekida dvostrukih lanaca DNK koji izazivaju neželjene mutacije tačaka i strukturne varijacije, nisku efikasnost uređivanja sa kojom se suočavaju mnogi nekonvencionalni organizmi i ne- deljenje ćelija i poteškoće sa ubacivanjem velikih fragmenata DNK. Štaviše, veoma složeno patentiranje CRISPR-a čini njegovu upotrebu u istraživanju i industriji često teškom i skupom.
Istraživačke grupe VIB-KULeuven Centra za mikrobiologiju i njihove kolege u VIB-UGent Centru za biologiju biljnih sistema sada su se pozabavile nedostacima ranije rekombinacije specifične za lokaciju kao sredstva za genomski inženjering. Tim je proširio kutiju sa alatkama koja koristi virusnu rekombinazu (Cre) tako da sada može posebno da prepozna, iseče i nalepi više DNK mesta. Tim je identifikovao skup od 16 lokacija koje se efikasno rekombinuju sa istom lokacijom, ali ne sa bilo kojom drugom lokacijom ovog skupa, i to za različite organizme.
„Zbog ovih ortogonalnih sistema rekombinacije, možemo izbeći nepredvidiv način na koji višestruka mesta rekombinacije u genomu međusobno komuniciraju“, kaže Kevin Verstrepen, direktor VIB-KULeuven centra za mikrobiologiju. „Ovo otvara puteve za mnoge istraživačke projekte za istovremeno instaliranje mnogih malih ili velikih genomskih uređivanja ili za više puta recikliranje markera tokom napora inženjeringa genoma.“
Charlotte Cautereels, Ph.D. student u laboratoriji Kevina Verstrepena, uspostavio je novu kutiju sa alatima u kvascu i testirao ih u bakterijskim ćelijama. Zatim je sarađivala sa VIB-UGent PSB centrom kako bi takođe pokazala njegovu efikasnost u biljnim ćelijama.
U svojoj najnovijoj publikaciji, ona pokazuje kako se može koristiti za optimizaciju ekspresije gena metaboličkog puta i proizvodnih titara industrijski relevantnih molekula. Jedan krug mešanja namenskih regulatora gena sa novim mestima rekombinacije je već udvostručio proizvodne titre.
„Uspeli smo da potvrdimo da modifikovanje ekspresije kroz našu postavku zasnovanu na rekombinaciji omogućava brzu i efikasnu optimizaciju ekspresije gena u heterolognim biosintetičkim putevima“, kaže Cautereels. „Ova nova kutija alata ne samo da nudi mogućnosti za poboljšanje fabrika mikrobnih ćelija, već takođe potvrđuje našu kutiju alata za naučnike i industriju koji rade u oblasti inženjeringa genoma.
