Sekvencionisanje celokupne RNK u ćeliji može otkriti mnogo informacija o funkciji te ćelije i šta ona radi u datom trenutku. Međutim, proces sekvenciranja uništava ćeliju, što otežava proučavanje tekućih promena u ekspresiji gena.
Alternativni pristup razvijen na MIT-u mogao bi omogućiti istraživačima da prate takve promene tokom dužeg vremenskog perioda. Nova metoda, koja se zasniva na neinvazivnoj tehnici snimanja poznatoj kao Ramanova spektroskopija, ne šteti ćelijama i može se izvoditi više puta.
Koristeći ovu tehniku, istraživači su pokazali da mogu da prate embrionalne matične ćelije dok se diferenciraju u nekoliko drugih tipova ćelija tokom nekoliko dana. Ova tehnika bi mogla da omogući proučavanje dugotrajnih ćelijskih procesa kao što su progresija raka ili embrionalni razvoj, a jednog dana bi se mogla koristiti za dijagnostiku raka i drugih bolesti.
„Ramanskim snimanjem možete izmeriti mnogo više vremenskih tačaka, što može biti važno za proučavanje biologije raka, razvojne biologije i brojnih degenerativnih bolesti“, kaže Peter So, profesor biološkog i mašinskog inženjerstva na MIT-u, direktor MIT-ovog Lasera. Biomedicinski istraživački centar, i jedan od autora rada.
Koseki Kobaiashi-Kirschvink, postdoktor na MIT-u i Broad institutu na Harvardu i MIT-u, je vodeći autor studije, koja se pojavljuje u Nature Biotechnologi. Stariji autori rada su Tomazo Bjankalani, bivši naučnik Instituta Broad; Jian Shu, docent na Harvardskoj medicinskoj školi i pridruženi član Instituta Broad; i Aviv Regev, izvršni potpredsednik u Genentech Research and Earli Development, koji je na odsustvu sa fakultetskih pozicija na Institutu Broad i Odeljenju za biologiju MIT-a.
Ramanova spektroskopija je neinvazivna tehnika koja otkriva hemijski sastav tkiva ili ćelija sijanjem blizu infracrvene ili vidljive svetlosti na njih. Centar za laserska biomedicinska istraživanja MIT-a radi na biomedicinskoj Ramanskoj spektroskopiji od 1985. godine, a nedavno su So i drugi u centru razvili tehnike zasnovane na Ramanskoj spektroskopiji koje bi se mogle koristiti za dijagnostikovanje raka dojke ili merenje glukoze u krvi.
Međutim, Ramanova spektroskopija sama po sebi nije dovoljno osetljiva da detektuje tako male signale kao što su promene u nivoima pojedinačnih molekula RNK. Za merenje nivoa RNK, naučnici obično koriste tehniku koja se zove jednoćelijsko sekvenciranje RNK, koja može otkriti gene koji su aktivni unutar različitih tipova ćelija u uzorku tkiva.
U ovom projektu, MIT tim je pokušao da kombinuje prednosti jednoćelijskog sekvenciranja RNK i Ramanove spektroskopije obučavanjem računarskog modela za prevođenje Ramanovih signala u stanja ekspresije RNK.
„RNK sekvenciranje vam daje izuzetno detaljne informacije, ali je destruktivno. Raman je neinvazivan, ali vam ne govori ništa o RNK. Dakle, ideja ovog projekta je bila da se koristi mašinsko učenje da se kombinuje snaga oba modaliteta, čime se omogućava da razumete dinamiku profila ekspresije gena na nivou jedne ćelije tokom vremena“, kaže Kobajaši-Kiršvink.
Da bi generisali podatke za obuku svog modela, istraživači su tretirali ćelije fibroblasta miša, vrstu ćelije kože, faktorima koji reprogramiraju ćelije da postanu pluripotentne matične ćelije. Tokom ovog procesa, ćelije takođe mogu da pređu u nekoliko drugih tipova ćelija, uključujući nervne i epitelne ćelije.
Koristeći Ramanovu spektroskopiju, istraživači su snimili ćelije u 36 vremenskih tačaka tokom 18 dana dok su se razlikovale. Nakon snimanja svake slike, istraživači su analizirali svaku ćeliju koristeći fluorescenciju jednog molekula in situ (smFISH), koja se može koristiti za vizuelizaciju specifičnih molekula RNK unutar ćelije. U ovom slučaju, tražili su molekule RNK koji kodiraju devet različitih gena čiji obrasci ekspresije variraju između tipova ćelija.
Ovi smFISH podaci mogu tada da deluju kao veza između podataka Ramanove slike i podataka sekvenciranja jednoćelijske RNK. Da bi napravili tu vezu, istraživači su prvo obučili model dubokog učenja da predvide ekspresiju tih devet gena na osnovu Ramanovih slika dobijenih iz tih ćelija.
Zatim su koristili računarski program pod nazivom Tangram, koji je prethodno razvijen u Institutu Broad, da povežu obrasce ekspresije smFISH gena sa celim profilima genoma koje su dobili izvođenjem jednoćelijskog RNK sekvenciranja na ćelijama uzorka.
Istraživači su zatim kombinovali ta dva računarska modela u jedan koji nazivaju Raman2RNA, koji može predvideti čitave genomske profile pojedinačnih ćelija na osnovu Ramanovih slika ćelija.
Istraživači su testirali svoj Raman2RNA algoritam praćenjem embrionalnih matičnih ćelija miša dok su se razlikovale u različite tipove ćelija. Uzeli su Ramanove slike ćelija četiri puta dnevno tokom tri dana i koristili svoj računarski model da predvide odgovarajuće profile ekspresije RNK svake ćelije, što su potvrdili upoređujući ih sa merenjima sekvenciranja RNK.
Koristeći ovaj pristup, istraživači su bili u mogućnosti da posmatraju prelaze koji su se desili u pojedinačnim ćelijama dok su se razlikovale od embrionalnih matičnih ćelija u zrelije tipove ćelija. Takođe su pokazali da mogu da prate genomske promene koje se dešavaju dok se fibroblasti miša reprogramiraju u indukovane pluripotentne matične ćelije, tokom dvonedeljnog perioda.
„To je demonstracija da optičko snimanje daje dodatne informacije koje vam omogućavaju da direktno pratite lozu ćelija i evoluciju njihove transkripcije“, kaže So.
Istraživači sada planiraju da koriste ovu tehniku za proučavanje drugih tipova populacija ćelija koje se menjaju tokom vremena, kao što su starenje ćelija i ćelije raka. Oni sada rade sa ćelijama uzgajanim u laboratorijskoj posudi, ali se u budućnosti nadaju da bi se ovaj pristup mogao razviti kao potencijalna dijagnostika za upotrebu kod pacijenata.
„Jedna od najvećih prednosti Raman-a je to što je metoda bez etikete. Daleko je, ali postoji potencijal za ljudski prevod, što se ne bi moglo uraditi korišćenjem postojećih invazivnih tehnika za merenje genomskih profila“, kaže Jeon. Voong Kang, naučnik MIT-a koji je takođe autor studije.
