Gaublomme laboratorija je razvila novi pristup optičkog skupnog skrininga nazvan CRISPRmap, koji omogućava spajanje optičkih svojstava pojedinačnih ćelija sa ciljanim genetskim perturbacijama. Optički fenotipovi su obično nedostupni za pristupe zasnovane na sekvenciranju zasnovane na lizi ćelija, ali uključuju ključne informacije kao što su morfologija ćelije, subćelijska lokalizacija proteina, interakcije ćelija-ćelija, faktori ekstracelularnog matriksa i organizacija tkiva.
CRISPRmap omogućava prostorno rešeno ispitivanje funkcije gena u tkivima, omogućavajući istraživačima da mapiraju i unutrašnje i ćelijske efekte perturbacija, koji nisu dostupni putem in vitro studija. Ovaj pristup otvara nove puteve za razumevanje gena uključenih u regrutovanje imunih ćelija za tumore, metastaze, invaziju, angiogenezu itd.
Grupa Gaublomme je podelila svoje nalaze u studiji koja je nedavno objavljena u Nature Biotechnologi.
Izvođenje ovih studija na objedinjeni način omogućava genetičke studije visoke propusnosti merenjem odgovora mnogih ćelija na različite genetske perturbacije paralelno. U objedinjenim analizama, svaka ćelija izražava RNK transkripte koji kodiraju bar-kod koji identifikuje koja se CRISPR perturbacija dogodila u toj ćeliji.
Posebno, CRISPRmap omogućava optičko očitavanje barkoda u izazovnim tipovima ćelija i kontekstima koji su ranije bili nedostižni za druge metode, uključujući matične ćelije, izvedene neurone i ćelije in-vivo unutar konteksta tkiva. Nakon što identifikuju koji gen je poremećen u datoj ćeliji, naučnici mogu naučiti o odgovoru ćelija i njihovog okruženja na ovu perturbaciju.
„Naša laboratorija je optimizovala CRISPRmap da bude kompatibilna sa testovima optičkog očitavanja, omogućavajući istovremeno multipleksirano profilisanje proteina i vrsta mRNA. Štaviše, CRISPRmap je agnostičan prema tipu genetske perturbacije, otvarajući put za istraživanje ciljanih mutacija, interferencije i aktivacije gena, epigenetskih modifikacija, i CRISPR RNA uređivanje“, objasnio je profesor Jellert Gaublomme, autor studije.
U saradnji sa laboratorijom Ciccia u Medicinskom centru Irving Univerziteta Kolumbija, autori su primenili CRISPRmap da bi istražili funkcionalne posledice 292 mutacije u 27 gena kritičnih za odgovor na oštećenje DNK, vizuelizujući regrutovanje proteina za popravku oštećenja DNK na mestima oštećenja DNK.
Oni su procenili ove odgovore nakon jonizujućeg zračenja ili agenasa koji oštećuju DNK koji se obično koriste kao hemoterapeutski lekovi kod raka dojke. Profilisanje ekspresije i subćelijske lokalizacije desetina vrsta proteina i mRNA u približno milion ćelija omogućilo je nijansirano ispitivanje varijantnih uticaja na odgovor na oštećenje DNK.
„Ovaj metod nam je omogućio da identifikujemo pogrešne varijante neizvesnog kliničkog značaja čiji odgovor podseća na poznate patogene varijante. Kao takav, naš pristup može pružiti okvir za označavanje ljudskih varijanti na način specifičan za lečenje i pomoći u određivanju prioriteta terapijskih strategija“, opisao je Jiacheng Gu, prvi autor studije.
Osim studija ćelijskih linija raka uzgajanih u posudi, istraživači su demonstrirali svoju CRISPRmap detekciju barkodova u ćelijama raka u mikrookruženju tumora, što je ključni cilj nagrade za novog inovatora direktora NIH-a koju je laboratorija dobila.
U saradnji sa laboratorijom Chan, profilisali su sekcije tumora pomoću CRISPRmap barkod detekcije i kombinovali očitavanje sa multipleksiranim bojenjem antitela da bi vizuelizovali angiogenezu, formiranje ekstracelularnog matriksa oko tumorskih domena i nuklearnu translokaciju transkripcionog faktora u transplantiranim ćelijama.
Kako je CRISPRmap primenljiv na različite CRISPR modalitete i tipove ćelija, tehnika se može koristiti za širok spektar istraživanja u biologiji i medicini. „Optimizirali smo naš pristup za široku dostupnost jer se ne oslanja na reagense za sekvenciranje trećih strana za detekciju bar kodova, boje za očitavanje mogu se prilagoditi tako da odgovaraju mikroskopima dostupnim istraživačima, a pristup je isplativ“, objasnio je Gu.
„Pretpostavljamo da će ovo dodatno omogućiti pojedinačnim laboratorijama da izvode studije perturbacije u njihovom interesnom tipu ćelije, istražujući biološke puteve na skali sličnom broju gena za koje se zna da igraju ulogu u tom putu“, dodao je Gaublomme.
Laboratorija Gaublomme planira da istraži uticaj genskih poremećaja na arhitekturu tkiva i interakciju između ćelija u složenim mikrookruženjima. Dalje studije bi se mogle fokusirati na organoide dobijene od pacijenata kako bi se proučavala funkcija gena u tkivu i kontekstu specifičnim za bolest.
„Zamišljamo CRISPRmap da razjasnimo optičke fenotipove u širokom rasponu skala biološke dužine, od molekularnih skala kao što su žarišta oštećenja DNK u jednom jezgru do ćelijske reorganizacije u čitavim organima.
„Pristup bi se mogao primeniti na studije koje se kreću od osnovne biologije do mehanizama bolesti i optimizacije terapijskih pristupa u razvoju, neurodegenerativnih bolesti i raka“, zaključio je Gaublomme.
