Imuni sistem našeg tela je složena mreža organa, ćelija i proteina koji rade sinhronizovano kako bi zaštitili naša tela od infekcija izazvanih patogenima i bore se protiv promena koje izazivaju bolesti u našem telu, kao što je pojava ćelija raka. Ćelijski posredovana citotoksičnost je jedan od takvih odbrambenih mehanizama koje sprovodi imuni sistem koji se bori protiv stranih ćelija.
Duboka analiza različitih igrača uključenih u citotoksičnost posredovanu ćelijama može pružiti uvid u normalne procese tokom dobrog zdravlja i odbrambene mehanizme tokom autoimunog poremećaja. Međutim, sadašnje metode analize nisu u stanju da precizno opišu zamršenost citotoksičnosti posredovane ćelijama jer ove metode usvajaju indirektan pristup.
Docent Cheov Lih Feng sa Instituta za zdravstvene inovacije i tehnologiju NUS-a, zajedno sa članovima svog tima dr Luah Ien Hoon i dr Vu Tongjin, osmislili su jednostavan i inovativan način da direktno identifikuju i sortiraju imune ćelije uključene u ćelije posredovana citotoksičnost.
„Nova metodologija koju je predložio moj tim je veoma selektivna u identifikaciji ćelija ubica koje su sposobne da efikasno eliminišu ciljnu ćeliju. Ovo je u suprotnosti sa drugim tehnikama karakterizacije citotoksičnosti posredovanih ćelijama, koje su naporne, dugotrajne i manje selektivne, “, rekao je Cheov, koji je takođe sa Odseka za biomedicinsko inženjerstvo pri NUS College of Design and Engineering.
Ova nova metoda je objavljena u Nature Biomedical Engineering 31. avgusta 2023.
Tokom ćelijski posredovane citotoksičnosti, neke imune ćelije mogu uništiti strane ćelije putem ćelijske lize oslobađanjem proteina koji pokreću kaskadu ćelijskih procesa koji uništavaju strane ćelije. Ove imune ćelije koje su pokazale ponašanje ubijanja ćelija nazivaju se ćelije ubice. Jednom kada su ove strane ćelije ubijene ili lizirane, one će prosuti svoj unutarćelijski sadržaj u okolno područje.
Nadovezujući se na ovaj koncept, NUS tim je predložio način da se „oboji“ površina ćelija ubica odgovornih za uništavanje ovih stranih ćelija. Istraživači su ovu novu metodu nazvali PAINTKiller (za „identifikacija intracelularnog transfera ćelija ubica bliskog afiniteta“).
Istraživači NUS-a su koristili intracelularnu boju za bojenje poznatu kao karboksifluorescein sukcinimidil estar (CFSE) za bojenje stranih ćelija. Ova netoksična boja može ući i zadržati se u ćelijama. Tim je zatim modifikovao površinu imunih ćelija tako da imaju ovaj receptor da uhvati CFSE boju kada je otpuste strane ćelije tokom ćelijske lize, omogućavajući im da identifikuju ćelije ubice koje su odgovorne.
Nakon uspešnog dizajna PAINTKiller metode, Cheov i njegov tim su sproveli eksperiment kako bi istražili mogućnost upotrebe PAINTKiller-a za sortiranje podtipova ćelija ubica uključenih u citotoksičnost posredovanu ćelijama. Tim je pokazao da ćelije ubice koje su obeležene bojom CFSE pokazuju bolje performanse u ubijanju stranih ćelija u poređenju sa ćelijama ubicama koje nisu obeležene.
Koristeći CFSE boju kao identifikator, istraživači NUS-a su bili u mogućnosti da sortiraju i ekstrahuju podtipove ćelija ubica i uzgajaju ih odvojeno. Takođe su otkrili da imune ćelije koje su obeležene CFSE metodom PAINTKiller imaju bolji kapacitet ubijanja i da su ostale moćne čak i nakon 12 dana.
Ovi obećavajući rezultati sugerišu da bi PAINTKiller mogao da pruži potencijalnu strategiju za proizvodnju visokokvalitetnih ćelijskih imunoterapija.
Da bi demonstrirali fleksibilnost PAINTKillera, istraživači NUS-a su ga kombinovali sa metodom poznatom kao test sekrecije citokina (CSA), koji meri proteine nazvane citokini koje oslobađaju imune ćelije tokom imunološkog odgovora. Tokom ovog eksperimenta, tim je istovremeno označio površinu ćelija ubica receptorima koji mogu uhvatiti CFSE i citokine koji su važni proteini za signalizaciju ćelija.
Rezultati ovog eksperimenta su pokazali da je PAINTKiller moćno sredstvo za omogućavanje sveobuhvatne i fleksibilne detekcije ćelijski posredovane citotoksičnosti, sekrecije proteina i površinskih receptora pojedinačnih ćelija ubica na način visoke propusnosti.
Imajući u vidu složenost različitih mehanizama koji stupaju u igru tokom citotoksičnosti posredovane ćelijama, multimodalni jednoćelijski sistem visoke propusnosti koji može da meri citotoksičnu sposobnost, da ocrta karakteristike imunih ćelija i proteina, kao i da analizira ekspresiju gena će biti korisno za precizno proučavanje citotoksičnosti posredovane ćelijama.
U tom cilju, NUS tim je pomerio granice PAINTKiller metode i razvio jednoćelijski PAINTKiller-sek test, koji je radni tok sekvenciranja jedne ćelije koji integriše podatke iz transkriptomske analize, fenotipske analize i studija citotoksičnosti.
Ovaj radni tok dodaje standardnoj PAINTKiller metodi da istraži, na molekularnom nivou, karakteristike ćelija ubica obeleženih CFSE da bi se razumelo da li se one genetski razlikuju od ćelija ubica koje nisu obeležene CFSE. Sa PAINTKiller-sek testom, istraživači NUS-a su sproveli detaljnu analizu molekularnih faktora koji su u korelaciji sa aktivnošću ćelija ubice tokom citotoksičnosti posredovane ćelijama.
„Razstranost PAINTkiller-a ima značajno obećanje za poboljšanje ćelijske imunoterapije i unapređenje tokova proizvodnje ćelija. Ovaj inovativni pristup bi pružio koristan alat za sveobuhvatno podizanje kvaliteta i funkcionalnosti krajnjeg terapeutskog proizvoda, označavajući značajan napredak u ovoj oblasti, “ rekao je dr Vu.
NUS tim radi na proširenju svestranosti PAINTkiller metode testiranjem na različitim kombinacijama ubica i stranih ćelija kako bi otkrio biologiju koja stoji iza složenosti imunoloških odgovora i da bi je razvio kao integralni alat za istraživanje i kliničke primene.
