Dilataciona kardiomiopatija (DCM) je jedan od najčešćih uzroka srčane insuficijencije, koji pogađa skoro 1 od 400 ljudi širom sveta. Procenjuje se da oko 40%-50% slučajeva DCM-a ima prepoznatljiv genetski uzrok, što objašnjava zašto se poremećaj često javlja u porodicama.
U par novih studija objavljenih u Nature Communications, istraživači iz EMBL Heidelbergove Steinmetz grupe istražili su molekularne osnove određenog oblika porodičnog DCM-a i testirali pristupe za uređivanje gena za lečenje takvih poremećaja.
Oko 3% porodičnih slučajeva DCM uključuje mutacije u ključnom genu zvanom RBM20. Ovaj gen, koji pomaže da se reguliše vrsta obrade RNK koja se zove „alternativno spajanje“, pretežno se eksprimira u kardiomiocitima, odnosno ćelijama srčanog mišića. U prvoj od dve studije, Steinmetz grupa je istraživala molekularne puteve kojima mutacije u RBM20 utiču na funkciju kardiomiocita.
Defekt u genetskom kodu može izazvati bolest na različite načine. U određenim mutacijama, karakteristike bolesti (ili „fenotip“) nastaju zbog toga što mutacija poremeti normalnu funkciju gena. Ako neko razmišlja o ćeliji kao o složenoj mašini, mutirani gen se može smatrati pokvarenim zupčanikom koji usporava ili zaustavlja normalnu funkciju. Naučnici su dugo vremena verovali da je ovo glavni efekat mutacija RBM20 – sprečavalo je gen da obavlja svoju normalnu ulogu u spajanju RNK, što zauzvrat utiče na ćelijsku funkciju.
Međutim, kako je Steinmetz grupa istraživala u svojoj studiji, fenotip bolesti može biti uzrokovan i lažnim ponašanjem proteina, nanoseći štetu radeći ono što ne bi trebalo da radi ili što je tamo gde ne bi trebalo da bude. U gornjoj analogiji, moglo bi se misliti na to kao na neispravan deo koji curi ulje, što utiče na druge delove mašine i kvari ceo sistem.
U skladu sa prethodnim studijama, tim je pokazao da mutacija u genu može prouzrokovati da se protein RBM20 lokalizuje u citoplazmu ćelije umesto u jezgro gde se normalno nalazi. Dok je u citoplazmi, RBM20 može da formira štetne citoplazmatske granule koje pogoršavaju fenotip bolesti, slično drugim bolestima koje uključuju pogrešnu lokalizaciju proteina, kao što su neurodegenerativne bolesti i rak.
„Ova razlika može uticati na način na koji se pristupa terapiji“, rekla je dr Julija Kornienko. student u Steinmetz laboratoriji i prvi autor studije. „Dok bi, za mutaciju gubitka funkcije, održiva strategija bila da se ćeliji snabdeti više zdravog RBM20 kako bi se spasio defekt spajanja RNK, ovo ne bi funkcionisalo za pogrešno lokalizovani RBM20 jer ne bi imalo uticaja na lokalizaciju.“
Tim je zatim koristio CRISPR-Cas9 ekran za čitav genom i sortiranje ćelija sa omogućenom slikom (ICS) – metodu sortiranja ćelija sledeće generacije koju je unapredila Steinmetz laboratorija u saradnji sa BD Biosciences i drugim istraživačima u EMBL-u – da bi otkrio molekularne interaktore RBM20. Kroz ovaj proces, identifikovali su protein — TNPO3 — kao odgovoran za transport RBM20 iz citoplazme u jezgro. Takođe su otkrili da mutacije u RBM20 mogu sprečiti ovu interakciju, što dovodi do akumulacije RBM20 u citoplazmi.
„Postizanje obima genoma bez ICS tehnologije bilo bi veoma izazovno, ako je ikako moguće“, primetio je Kornienko. „Pored toga, raspoređenom ekranu, čak i za odabrani podskup genoma, trebalo bi znatno duže vreme.“
Kada su istraživači prekomerno eksprimirali TNPO3 u ćelijama, to je poboljšalo nuklearni uvoz RBM20 i preokrenulo defekte spajanja RNK uzrokovane mutacijama RBM20. Ovaj nalaz ima implikacije za razvoj novih terapijskih pristupa usmerenih na obnavljanje nuklearne lokalizacije RBM20, što tim trenutno dalje istražuje.
„Ovo je nova interakcija koja nikada ranije nije opisana“, rekao je Kornienko. „Trenutno radimo na dešifrovanju strukture kompleksa RBM20–TNPO3 u laboratoriji. Poznavanje tačne strukture kompleksa omogućiće nam da identifikujemo lekove malih molekula koji stabilizuju interakciju nakon mutacije i odaberemo biblioteku jedinjenja za testiranje terapeutskih efekata in vitro ili in vivo. Takođe istražujemo druge načine RBM koncepta lokalne nuklearne restauracije u veoma eksperimentalnom radu. novi pristup ciljanju RBM20 u DCM i nadamo se da bi to moglo poboljšati opcije terapije za pacijente sa RBM20 u budućnosti.“
U drugoj studiji, istraživači su zauzeli direktniji pristup preokretanju disfunkcije kardiomiocita izazvane RBM20 u mišjim modelima DCM.
Trenutne terapijske strategije za DCM su ozbiljno ograničene u svojoj efikasnosti i dostupnosti, a često je transplantacija srca jedina opcija za napredne pacijente. Još od otkrića sistema za uređivanje gena CRISPR-Cas9, naučnici istražuju njegov potencijal u lečenju ljudskih bolesti uzrokovanih mutacijama u specifičnim genima. Mnogi takvi pristupi zavise od procesa aktivnih u ćelijama koje se dele, čime se ograničava njihova primenljivost za zrele ćelije koje se ne dele, na primer, kardiomiocite ili nervne ćelije.
Laboratorija Steinmetz koristila je sistem zasnovan na CRISPR-u sledeće generacije koji se zove uređivanje baze koji se može koristiti u takvim postmitotskim ćelijama za selektivno preokretanje mutacija u RBM20 u kardiomiocitima. Da bi to uradili, ubrizgali su miševima koji nose Rbm20 mutacije sa specijalno kreiranim virusnim vektorom koji selektivno cilja na kardiomiocite i koji nosi sistem za isporuku gena koji omogućava da se genetski kod ovih ćelija uredi na mestu mutacije.
U roku od tri meseca od ovog tretmana, istraživači su primetili poboljšanje u nekoliko fenotipova bolesti, kao što su funkcija pumpanja srca, nedostatak spajanja i ekspresija biomarkera srčane insuficijencije. Procenjuju da bi mogli da preokrenu mutaciju u skoro 70% kardiomiocita kod miševa primaoca, što je impresivna brojka za terapije ove vrste. Zanimljivo je da je uređivanje gena takođe preokrenulo citoplazmatsku pogrešnu lokalizaciju proteina RBM20 kod ovih miševa. Važno je da istraživači nisu videli nikakvo uređivanje van cilja u drugim delovima tela – najveća rezerva za prenošenje CRISPR-Cas9 pristupa uređivanja u klinike.
„Naterati ovu metodu da radi na modelima miša bilo je prilično izazovno“, rekao je Markus Groš, postdoktor u laboratoriji Steinmetz i prvi autor ove studije. „Povećanjem količine virusa, smanjenjem starosti (a samim tim i težine) miševa i upotrebom virusa specifične za kardiomiocite, mogli bismo dramatično povećati efikasnost uređivanja.“
Istraživači veruju da bi u budućnosti, pored toga što bi služila kao mogući tretman za pacijente sa DCM, takva strategija bi takođe mogla imati potencijal kao preventivna mera za one u veoma ranim stadijumima bolesti ili one koji nose slične genetske mutacije, ali još nisu razvili DCM.
„Naš tim ima za cilj da istraži strategije za uređivanje genoma kako bi razumeo genetsku osnovu složenih fenotipova i na taj način transformisao način na koji vršimo biomedicinska istraživanja“, rekao je Lars Štajnmetz, profesor Fondacije Diter Švarc i vođa pridružene grupe u EMBL Hajdelbergu. „DCM je jedan od vodećih uzroka srčane insuficijencije i uprkos velikom napretku u medicini, ne postoje ciljane terapije koje su dostupne pacijentima. Studije kao što je naša proučavaju biologiju iza bolesti kako bi identifikovale nove terapeutske puteve i strategije za rešavanje biomedicinskih izazova u budućnosti.“
