Delikatne ćelijske strukture i dinamički procesi unutar ćelija koji su do sada bili nevidljivi mogli bi se otkriti sledećom generacijom zelenog fluorescentnog proteina koji su razvili hemičari u RIKEN-u.
Zeleni fluorescentni proteini se široko koriste u biološkim istraživanjima za osvetljavanje struktura od interesa u fluorescentnoj mikroskopiji. Emituju zeleno svetlo kada su osvetljeni plavim ili ultraljubičastim svetlom.
Prethodno, Atsushi Miiavaki iz RIKEN Centra za nauku o mozgu i njegovi saradnici su izveli zeleni fluorescentni protein iz prirodnog fluorescentnog proteina napravljenog od male japanske meduze. On je prevazišao uobičajeni problem sa zelenim fluorescentnim proteinima, naime oni postaju tamniji pod snažnim ili dugim osvetljenjem koje se koristi u fluorescentnom snimanju živih ćelija.
Ćelijski proteini označeni zelenim fluorescentnim proteinom, koji je tim nazvao StayGold, mogli bi se pratiti u živim ćelijama tokom dužeg vremenskog perioda. „To je veoma svetao i fotostabilan zeleni fluorescentni protein“, kaže Mijavaki. „To ga čini korisnim za snimanje različitih komponenti u ćelijama sa poboljšanom rezolucijom i tokom dugog vremena.“
Jedno ograničenje kod originalnog StayGold-a, međutim, bila je njegova sklonost da se uparuje i formira dimere – molekule sastavljene od dva identična gradivna bloka, ili monomera. Ovo može izazvati probleme sa nekim proteinima.
„Formiranje dimera može ometati funkcije proteina domaćina na koje se StayGold spaja“, objašnjava Mijavaki. „Na primer, to može dovesti do umreženih eksperimentalnih artefakata u nekim proteinima domaćina.“
Da bi prevazišao ovo ograničenje, tim je odredio kristalnu strukturu zelenog fluorescentnog proteina kako bi identifikovao strukturne karakteristike koje mogu pokrenuti formiranje dimera. Zatim su koristili usmerenu evoluciju da modifikuju strukturu proteina u ovim ključnim tačkama. Njihov cilj je bio da potisnu formiranje dimera bez narušavanja sjaja ili stabilnosti zelenog fluorescentnog proteina.
Zanimljivo je da se varijanta za formiranje monomera koju su istraživači razvili još svetlija i fotostabilnija od prve generacije StayGold-a.
Istraživači su demonstrirali potencijal njihove monomerne varijante u nekoliko studija živog fluorescencije. Istraživanje je objavljeno u časopisu Nature Methods.
„Koristili smo monomer da označimo filamente aktina i unutrašnje membrane mitohondrija“, kaže Mijavaki. „To nam je omogućilo da uspešno snimimo ove strukture sa poboljšanom prostorno-vremenskom rezolucijom i tokom dužeg perioda posmatranja.“
Tim sada nastoji da razjasni molekularnu osnovu izuzetne fotostabilnosti varijante. Oni takođe nastoje da razviju fotostabilan, fluorescentni protein koji emituje crveno, koji bi se mogao koristiti u kombinaciji sa StayGold-om ili njegovim monomerom za živo fluorescentno snimanje.
