Sintetički biolozi sa Univerziteta Rajs i Univerziteta Prinston demonstrirali su tehnologiju „reportera uživo” koja može da otkrije rad mreža signalnih proteina u živim ćelijama sa daleko većom preciznošću od trenutnih metoda. Prvi alat za izveštavanje ove vrste može da pokaže, na primer, koliko brzo signalne mreže reaguju i kako se njihovi odgovori razlikuju od ćelije do ćelije u vremenu i prostoru.
Istraživači su kreirali alat koristeći nenametljive proteine koji se povezuju sa suštinskim signalnim mehanizmom koje ljudske ćelije koriste za regulisanje rasta, diferencijacije, migracije, upale i drugih procesa.
U studiji, nedavno objavljenoj u časopisu otvorenog pristupa eLife, tim Rice-Princetona je pokazao svoj modularni pristup za označavanje receptorskih tirozin kinaza (RTK) sa reporterskim proteinima koji aktiviraju zelene fluorescentne proteine kad god njihovi RTK partneri postanu fosforilisani.
Kinaze su enzimi koji mogu da promene ponašanje drugih proteina vezivanjem ili odvajanjem fosfatnih grupa, proces koji se naziva fosforilacija. RTK su specijalizovane kinaze koje same postaju fosforilisane kada detektuju dolazne signale ili stimuluse van ćelije, a zatim regulišu vitalne ćelijske funkcije.
Tim je pokazao da se sistem „reporter uživo“ može koristiti sa mikroskopom za proizvodnju video zapisa signalne mrežne aktivnosti u živim ćelijama. Gde ćelije sijaju i koliko sjajno, otkriva lokaciju i intenzitet odziva signalne mreže, rekao je Kaleb Bašor, ko-korespondentni autor studije i docent za bioinženjering i bionauke u Rajsu. Timelapse iRFP-ZtSH2 u NIH3T3 ćelijama koje ko-eksprimiraju iRFP-ZtSH2 i EGFR-CD3ε-FusionRed. Ćelije su prvo tretirane sa EGF (100 ng/mL), a zatim sa gefitinibom (10 µM) u vremenima navedenim u video snimku. Kredit: eLife (2023). DOI: 10.7554/eLife.82863
„Većinu vremena, kada proučavate stvari koje se dešavaju unutar ćelija, kao što su signalne mreže ili mreže gena, morate da uništite ćelije da biste pogledali njihov sadržaj“, rekao je Bašor. „Kad god možete da napravite nešto gde ćelije ostaju žive, i možete gledati kako signalna mreža radi u realnom vremenu, unutar ćelije, to je velika prednost.
Istraživači su novinare nazvali pItags, u odnosu na biohemijsku nomenklaturu gde je tirozin označen kao „I“ i kao „pI“ kada je fosforilisan.
Bašor i Sjaoju Jang, dr. student u Bašorovoj istraživačkoj grupi, razvio je pItags u saradnji sa istraživačkim grupama Džereda Točera sa Prinstona i Selest Nelson. Studija je pokazala da sistem može da snimi aktivnost RTK-a nazvanih receptori faktora rasta u ljudskim ćelijama fibroblasta.
„Uzmemo projektovani protein koji je deo drugačijeg sistema – to je zapravo deo imunološke signalizacije – i stavljamo ga u ovaj novi kontekst, a to su ćelije fibroblasta sa kojima Džared radi u svojoj laboratoriji na Prinstonu“, rekao je Bašor. „Mislimo da verovatno nije u interakciji ni sa čim drugim u ćeliji jer je iz potpuno drugačijeg tipa ćelije. Dakle, samo nekako visi na kraju receptora faktora rasta.“
PItag reporter je dizajniran da ko-aktivira sa svojim RTK partnerom i aktivira proporcionalnu količinu fluorescencije. Dakle, što je jači RTK odgovor, ćelija svetliće kada se posmatra kroz mikroskop.
„Može da primi taj signal fosforilacije od receptora faktora rasta“, rekao je Bašor. „Dakle, kada se receptor aktivira, zeleni fluorescentni protein ulazi, vezuje se za nešto blizu membrane i dobijate ono što izgleda kao ovaj zeleni prsten oko spoljašnje strane ćelije. To vam govori, u realnom vremenu, kada ćelije vide faktor rasta i koliko brzo se put uključuje.“
Bašor je rekao da se pItags mogu koristiti za praćenje mnogih tipova receptora tirozin kinaze.
„U radu smo pokazali da se ovaj reporter može staviti na više različitih tipova receptora faktora rasta i da se može koristiti kao reporter za sve njih“, rekao je on. „Ovo je prozor u dinamiku ćelijske signalizacije koju zaista nismo imali ranije.“
