Rad istraživača uključuje ne samo kontinuiranu potragu za novim otkrićima, već i pažljivu pažnju na konvencionalno, utvrđeno znanje. Ponekad, pouzdane i naizgled dokazane metode imaju karakteristike koje su ranije bile zanemarene.
Grupa istraživača na čelu sa Aleksandrom Tonevickim, dekanom Biološko-biotehnološkog fakulteta Univerziteta HSE, otkrila je takve karakteristike u metodi prekomerne ekspresije mikroRNA. Naučnici su otkrili da, u nekim slučajevima, rezultati eksperimenata koji koriste ovu metodu mogu biti netačni, a ove greške je veoma teško otkriti. Nalazi su objavljeni u časopisu Biochimica et Biophisica Acta (BBA)—Geni regulatorni mehanizmi.
MikroRNA (miRNA) su mali RNK molekuli, dužine približno 20 do 25 nukleotida. Oni igraju važnu ulogu u regulisanju ekspresije gena tako što određuju koliko će proteina biti sintetizovano u ćeliji iz specifičnog molekula glasničke RNK (mRNK). Ova regulacija je olakšana kratkim fragmentom unutar miRNK, koji se može vezati za ciljni mRNK molekul ako pronađe reverznu (biološki kompatibilnu) sekvencu. Kada se to dogodi, sinteza proteina iz iRNK se zaustavlja, što dovodi do smanjenja ekspresije gena.
Kako bolesti, uključujući rak, napreduju, primećuju se promene u nivoima ekspresije mikroRNK. Konkretno, kod raka prostate, broj mikroRNK miR-93-5p se povećava, a viši nivoi njihove ekspresije su povezani sa većom agresivnošću bolesti. Značajnim povećanjem broja miRNA u laboratorijskim ćelijama, istraživači mogu da steknu jasnije razumevanje procesa povezanih sa povišenom ekspresijom ove miRNA.
Uobičajeni pristup za prekomernu ekspresiju miRNA uključuje početno povećanje količine prekursora RNK u ćelijama — duži molekul iz kojeg se miRNA naknadno generiše cepanjem od strane Dicer enzima. Ovo je prirodan proces za ćeliju. Međutim, sekvenca miRNA koja se formira kao rezultat zavisi od toga koliko tačno enzim Dicer cepa molekul prekursora.
Autori rada proučavali su kako enzim Dicer cepa molekul. Oni su kodirali željenu sekvencu u molekulu prekursora, predviđajući da će ga Dicer tačno odvojiti kako je predviđeno. Međutim, pokazalo se da Dicer ne funkcioniše uvek kako naučnici očekuju. Enzim prvenstveno funkcioniše kao molekularni lenjir, dosledno meri dužinu od 22 nukleotida.
Tokom sinteze molekula prekursora, jedan ili više uracila (nukleotidna baza jedinstvena za RNK) se obično dodaje na kraj sekvence. Kao rezultat toga, ako je data miRNA sekvenca duža od 19 nukleotida, dodati uracili izazivaju da Dicer cepa molekul na nenamernoj lokaciji. Ova promena dovodi do formiranja izoformi miRNA.
Da bi istražili uzrok promene položaja cepanja molekula prekursora, naučnici su eksperimentalno postavili nekoliko miRNA sekvenci različitih dužina, uključujući lanac od 23 nukleotida koji odgovara miR-93-5p miRNA. Koristeći sekvenciranje – metod koji u potpunosti dešifruje nukleotidnu sekvencu molekula RNK ili DNK – naučnici su primetili da dodani uracili u lancima dužim od 19 nukleotida izazivaju promenu položaja cepanja.
Formiranje miR-93-5p izoformi miRNA rezultiralo je smanjenjem ekspresije gena HMGA1, koji igra ulogu u ometanju prenosa genetskih informacija tokom ćelijske deobe i u regulisanju ekspresije gena. Međutim, HMGA1 nije bio meta standardnog oblika miR-93-5p. Bez znanja o formiranju izoforme miRNA, mogli bi se izvući pogrešni zaključci o molekularnim mehanizmima proučavane miRNA kod raka prostate.
„Izoformi mogu da ciljaju pogrešne molekule iRNK umesto onih predviđenih u eksperimentu, što dovodi do supresije neželjenih gena. Razumevanje ove osobenosti je ključno i za osnovna istraživanja i za medicinsku primenu“, kaže Diana Maltseva, šef Međunarodne mikrofiziološke laboratorije Sistemi na HSE univerzitetu.
Naučnici širom sveta koriste metod prekomerne ekspresije miRNA u svojim eksperimentima. Tipično, tačnost rezultata se proverava korišćenjem lančane reakcije polimeraze (PCR). Međutim, ovaj metod u ovom slučaju nije bio dovoljno osetljiv.
„Naša studija je pokazala da samo sekvenciranje može otkriti pomak u poziciji cijepanja. Nažalost, sekvenciranje je relativno skupa metoda i ne mogu je sve laboratorije priuštiti. Stoga je ključno razviti nove metode za prekomjernu ekspresiju miRNA i dizajnirati eksperimente pažljivo“, komentariše Malceva.
