Naučnici sa Harvarda predstavili su novu tehniku nazvanu sekvenciranje genoma ekspanzije in situ (EkIGS) koja kombinuje postojeće sekvenciranje in situ genoma (IGS) sa ekspanzionom mikroskopijom (EkM). Inovacija je omogućila istraživačima da povežu abnormalnosti jezgra sa promenama u regulaciji gena unutar jedne ćelije uz precizna merenja interakcija DNK-protein na nanometarskoj skali.
Mikroskopija je suštinski alat za karakterizaciju funkcije ćelije. Metode snimanja su ograničene granicom difrakcije optičke mikroskopije, sprečavajući pouzdano merenje na skali interakcija DNK-protein.
Ekspanziona mikroskopija je pametna tehnika koja prevazilazi problem sagledavanja stvari skrivenih granicom difrakcije tako što ih čini većim. Ugrađivanjem uzorka u polimerni gel koji bubri i širenjem, istraživači mogu da dobiju slike prostornih organizacija unutar ćelija u superrezoluciji koristeći konvencionalne mikroskope.
U EkIGS-u, ekspanziona mikroskopija je integrisana sa sekvenciranjem genoma in situ da bi se istovremeno sekvencirala genomska DNK i slikali nuklearni proteini u rezoluciji nanorazmera unutar pojedinačnih ćelija.
Proces počinje ugradnjom fiksnih ćelija u gel na bazi poliakrilata, koji služi kao skela za ekspanziju. Genomska DNK i proteini su hemijski povezani sa gelom pomoću DNK oligo kukica koje se vezuju za DNK ukosnice pričvršćene za genomske fragmente i proteine. Ove kuke sadrže hemijske grupe koje formiraju kovalentne veze sa gelom tokom polimerizacije.
Kada se jednom ugradi, gel polimerizuje oko fiksnih ćelijskih komponenti, imobilizujući DNK i proteine. Voda se dodaje u gel što dovodi do njegovog ravnomernog bubrenja približno 4,5 do 5,5 puta u svim pravcima. Ova ekspanzija fizički uvećava ćeliju uz očuvanje prostornih odnosa između molekula. Da bi se održao integritet novoproširene strukture, uzorak se zatim ponovo ugrađuje u sekundarni neekspandirajući akrilamidni gel.
Prošireni uzorak se podvrgava imunofluorescentnom snimanju u superrezoluciji, omogućavajući detaljnu vizualizaciju nuklearnih proteina. Zatim se vrši amplifikacija u krugu da bi se generisali klonalni DNK amplikoni, koji se sekvenciraju in situ. Ova amplifikacija obezbeđuje tačno sekvenciranje i lokalizaciju genomske DNK unutar proširenog jezgra.
Istraživači detaljno opisuju testiranje svoje inovacije u preprint papiru, „Sekvencioniranje genoma ekspanzije in situ povezuje nuklearne abnormalnosti sa žarišnim tačkama aberantne represije euhromatina“, na biorXiv serveru za preprint.
Primenom EkIGS-a na ćelije fibroblasta od pacijenta sa Hačinson-Gilfordovim progerijskim sindromom, istraživači su identifikovali nepravilnosti u nuklearnim laminima (proteini koji daju strukturu jezgru) koji stvaraju žarišta abnormalne represije u aktivnim genomskim regionima, potencijalno kompromitujući ćelijski identitet.
Studija je pokazala da EkIGS značajno povećava broj genomskih očitavanja po jezgru i čuva 3D strukturu genoma uporedivu sa Hi-C podacima sekvenciranja.
Tehnika pruža moćnu novu platformu za istraživanje interakcija DNK-proteina, omogućavajući istraživačima neviđen pogled na molekularne mehanizme. To bi moglo značajno poboljšati naše razumevanje širokog spektra bolesti i genetskih poremećaja, otkriti skrivene interakcije ćelijskog starenja u starenju i postati disruptivna tehnologija u biotehnološkim istraživačkim laboratorijama.
