Tim istraživača predvođen profesorom Sebastijanom Deindlom sa Univerziteta u Upsali razvio je pionirski metod koji značajno poboljšava sposobnost posmatranja i analize složenih bioloških procesa na nivou jednog molekula. Njihov rad je objavljen u časopisu Nauka.
„Sa našom novom tehnikom, sada možemo proširiti biofiziku jednog molekula na skalu genoma. Očekuje se da će ovaj napredak značajno produbiti naše razumevanje o tome kako proteini u interakciji nukleinske kiseline funkcionišu iu zdravlju i bolesti“, kaže profesor Deindl, stariji autor studija.
Metoda, koja se zove MUSCLE (multipleksna karakterizacija jednog molekula na bibliotečkoj skali), otvara vrata preciznijim i sveobuhvatnijim studijama bioloških sistema, gde je razumevanje celog spektra molekularnog ponašanja kritično. Očekuje se da će imati dubok uticaj na proučavanje složene molekularne dinamike kao funkcije sekvence ili hemijskog prostora, omogućavajući istraživačima da istraže ranije neistražene teritorije u biologiji.
Novorazvijeni metod prevazilazi značajna ograničenja u oblasti fluorescentne mikroskopije sa jednim molekulom, koja je do sada bila ograničena malom propusnošću zbog naporne prirode analize jednog po uzorka. Tradicionalni pristupi su ograničeni na proučavanje malog broja reprezentativnih uzoraka, što bi moglo dovesti do pristrasnosti i propuštenih mogućnosti za otkrivanje novih uvida u velikim bibliotekama molekula.
MUSCLE se bavi ovim izazovom kombinujući mehaničke uvide iz fluorescentne mikroskopije sa jednim molekulom sa mogućnostima visoke propusnosti sekvenciranja sledeće generacije. Tok posla počinje pričvršćivanjem biblioteke fluorescentno obeleženih molekula na površinu poznatu kao Illumina MiSek protočna ćelija. Ova protočna ćelija se zatim postavlja na fluorescentni mikroskop sa jednim molekulom pomoću 3D štampanog adaptera, omogućavajući istraživačima da posmatraju dinamiku pojedinačnih molekula u realnom vremenu u više vidnih polja.
Nakon snimanja, protočna ćelija se podvrgava standardnom Illumina sekvenciranju, koje generiše klastere identičnih kopija iz prethodno posmatranih molekula. Ovi klasteri se zatim poklapaju sa odgovarajućim molekulima na osnovu njihovih pozicija na protočnoj ćeliji.
„Pokazalo se da je prostorno registrovanje snimaka sa jednim molekulom i sekvenciranja Illumina izuzetno izazovno, ali problem je sada rešen“, kaže dr Anton Sabancev, zajednički prvi autor studije.
Ovaj inovativni pristup omogućava istraživačima da istovremeno profilišu dinamiku velikog broja uzoraka, pružajući sveobuhvatnije razumevanje složenih bioloških procesa.
„Naš metod omogućava direktno posmatranje dinamičkog molekularnog ponašanja u obimnim bibliotekama, značajno povećavajući našu sposobnost da otkrijemo opšte trendove, izvanredna ponašanja i jedinstvene dinamičke potpise koji bi inače ostali skriveni. Spreman je da transformiše način na koji proučavamo složenu dinamiku biomolekule, sa širokom primenom u molekularnoj biologiji, genetici i otkrivanju lekova“, kaže profesor Deindl.
Prvi zajednički autori studije, dr Havijer Agire Rivera, dr Guandžong Mao, dr Sabancev i M. Panfilov, dali su značajan doprinos razvoju i validaciji ove nove tehnike.
„Ključ za ovaj veoma izazovan višegodišnji napor bio je divan timski rad naših članova. Svako je doneo nešto drugačije na sto, što je bilo ključno za prevazilaženje tehničkih prepreka sa kojima smo se suočili“, kaže dr Mao.
Istraživački tim je takođe uključivao Magnusa Lindela iz Nacionalne genomske infrastrukture SciLifeLab u Upsali, čija je stručnost bila ključna za integraciju sekvenciranja sledeće generacije u tok rada MUSCLE. U svojim početnim eksperimentima, tim je primenio metodu da profiliše dinamiku DNK ukosnice i odmotavanje/premotavanje DNK izazvano Cas9. Njihovi nalazi su otkrili neočekivana ponašanja u određenim ciljnim sekvencama, naglašavajući potencijal metode da otključa nove biološke uvide.
S obzirom da se oslanja na široko dostupnu fluorescentnu mikroskopiju i MiSek instrumente, zajedno sa lakoćom izrade potrebnog adaptera pomoću 3D štampanja, metoda je veoma dostupna široj naučnoj zajednici. Može se prilagoditi za proučavanje širokog spektra proteina koji stupaju u interakciju sa nukleinskim kiselinama, kao i DNK-barkodiranih proteina, jedinjenja ili liganda.
