Inovativni alat za ciljanu modifikaciju genske aktivnosti u ćelijama srčanog mišića mogao bi da se uspostavi kao standardni metod za istraživanje kardiovaskularnih bolesti.
Dr Patrick Laurette i njegove kolege iz Nemačkog centra za kardiovaskularna istraživanja (DZHK), na čelu sa prof. Ralfom Gilsbachom, uspešno su smanjili aktivnost pojedinačnih gena u ćelijama srčanog mišića miša pomoću sistema CRISPRi.
Ova tehnologija omogućava privremeno suzbijanje ekspresije gena bez promene genetske sekvence. Time se izbegavaju potencijalni rizici povezani sa direktnom intervencijom u genomu. Studija je objavljena u časopisu Circulation Research.
CRISPRi je zasnovan na CRISPR-Cas sistemu za uređivanje genoma, ali mu nedostaje sposobnost da seče DNK, takozvani „mrtvi CAS“ (dCAS) i spojen je sa KRAB represorskim domenom. Korišćenjem kratke RNK kao molekularnog vodiča, dCas9 se može vezati za specifične sekvence DNK. Kao rezultat toga, ciljni region u genomu je epigenetski utišan i gen se više ne može čitati. Ova blokada se naziva „epigenetsko utišavanje“.
Da bi uveli sistem CRISPRi u ćelije srčanog mišića miševa, istraživači su koristili viruse povezane sa adeno (AAV), koji se ne integrišu u genom. Jedan izazov je bio da se ceo sistem upakuje u ograničeni genomski kapacitet AAV-a. Istraživači su uspeli u tome koristeći posebno mali dCAS. Iako drugi virusni vektori imaju veći kapacitet u ovom pogledu, oni ne mogu efikasno da dođu do ćelija srčanog mišića ili da se integrišu u genom.
Dr Patrick Laurette i njegove kolege u Univerzitetskoj bolnici Hajdelberg demonstrirali su koliko dobro epigenetsko utišavanje sa AAV-CRISPRi sistemom funkcioniše u srčanim ćelijama za nekoliko gena i pojačivača. Aktivnost nekih gena smanjena je i do 95 procenata. Pojačivači su regulatorni elementi koji mogu fino podesiti ekspresiju gena iz udaljenih genomskih regiona.
„Složenost organizma sisara je rezultat oko milion regulatornih elemenata. Postoji između 50.000 i 100.000 ovih pojačivača samo u ćelijama srčanog mišića“, kaže prof. Ralf Gilsbach. Oni se sada fokusiraju na modulaciju ovih regulatornih elemenata koristeći svoju novu metodu za lečenje bolesti kao što su srčana insuficijencija ili srčana aritmija.
Gilsbach naglašava translacioni značaj ovog pristupa, koji omogućava da se specifično utiče na ekspresiju gena in vivo bez promene sekvence DNK. Metoda je takođe titrabilna, što znači da se može regulisati i njen efekat se može obrnuti. U poređenju sa drugim metodama, kao što je genetski nokaut, u kojem se geni uništavaju, AAV-CRISPRi sistem nudi precizniju imitaciju prirodnih regulatornih mehanizama.
Metodički optimizovan i dalje razvijen, postupak bi se mogao koristiti i za terapiju ljudi na duži rok. „Uveren sam da ovaj pristup ima translacioni značaj, čak i ako je teško predvideti koliko će se brzo razvoj ovde nastaviti“, kaže Gilsbah.
Već postoje brojne kompanije koje razmatraju AAV da isporuče CRISPR komponente za terapije. Između ostalog, rade na izbegavanju neželjenih reakcija na antitela. To je zato što ljudi imaju antitela protiv AAV-a, a često i protiv CRISPR proteina dobijenog iz bakterija.
