Nova metoda analize može brže i preciznije otkriti patogene u uzorcima krvi od hemokultura, što je trenutno stanje tehnike za dijagnostiku infekcije. Nova metoda, nazvana digitalna analiza topljenja DNK, može dati rezultate za manje od šest sati, dok kultura obično zahteva 15 sati do nekoliko dana, u zavisnosti od patogena.
Ne samo da je ova metoda brža od hemokultura, već je i značajno manja verovatnoća da će generisati lažne pozitivne rezultate u poređenju sa drugim novim tehnologijama zasnovanim na detekciji DNK, kao što je sekvenciranje sledeće generacije.
To je iskustvo koje je većina roditelja imala: vodite dete kod lekara jer ima temperaturu, možda kašlje ili kija. Vaše dete ima infekciju, kaže doktor, ali nije jasno da li je bakterijska ili virusna. Ponekad će lekar prepisati antibiotike „za svaki slučaj“.
Ponekad će naručiti vađenje krvi da vide da li su prisutne bakterije. Ponekad će rezultat biti negativan dva do tri dana kasnije, u kom trenutku će od vas biti zatraženo da nastavite da dajete antibiotike svom detetu kako ono ne bi počelo da uzgaja bakterije otporne na antibiotike u svom telu.
Isti scenario se dešava u pedijatrijskim odeljenjima intenzivne nege i urgentnim sobama, sa većim ulozima kada dete ima simptome sepse. U ovom slučaju, do 30% pacijenata dobije pogrešan tretman, što ih zapravo dovodi u veći rizik od umiranja. Kod sepse, brzina je još važnija, jer se rizik od smrtnosti povećava za 4% svakog sata kada infekcija ostane nedijagnostikovana ili netačno lečena.
Istraživači su sproveli pilot kliničku studiju uzoraka krvi pedijatrijskih pacijenata i pokazali da se rezultati njihove metode tačno poklapaju sa rezultatima hemokulture u otkrivanju sepse. Ali njihova metoda je otkrila patogene 7,5 sati do oko 3 dana brže od kliničke hemokulture. Testovi takođe idu dalje od jednostavnog pozitivnog ili negativnog rezultata kako bi se kvantifikovala količina patogena u uzorcima.
Metoda se oslanja na univerzalno digitalno topljenje DNK visoke rezolucije, gde se DNK zagreva dok se ne raspadne. Svaka sekvenca DNK ima specifičan potpis tokom topljenja. Dok se proces topljenja snima i analizira, algoritmi mašinskog učenja određuju koji su tipovi DNK prisutni u uzorcima i identifikuju patogene.
Istraživački tim predstavlja svoje nalaze u časopisu The Journal of Molecular Diagnostics.
„Ovo je prvi put da je ova metoda testirana na punoj krvi pacijenata za koje se sumnja da imaju sepsu. Tako da je ova studija realističniji pregled kako bi tehnologija mogla da funkcioniše u stvarnim kliničkim scenarijima“, rekla je Stephanie Fralei, viši autor i profesor na odseku za bioinženjering Shu Chien-Gene Lai na Kalifornijskom univerzitetu u San Dijegu.
Procenjuje se da je jedan od svakih pet smrtnih slučajeva širom sveta posledica komplikacija povezanih sa sepsom. A 41% ovih smrtnih slučajeva javlja se kod dece. Rano otkrivanje je ključno za preživljavanje sepse, jer se rizik od smrtnosti povećava za 4% svakih sat vremena kada infekcija ostane nedijagnostikovana ili netačno lečena.
Obično lekari pacijentima sa sepsom daju antibiotike dok čekaju rezultate hemokulture. Ovo može dovesti do rezistencije na antibiotike.
„Suština je da ne lečimo na osnovu dokaza“, rekao je Fralei. „I što više lečimo bez dokaza, to više možemo da izazovemo neželjene probleme. Ponekad lečimo pacijente koji imaju gljivične ili virusne infekcije antibakterijskim sredstvima. Ovo može izazvati rezistenciju na antibiotike i značajno promeniti mikrobiom pacijenta.“
Sve je počelo sa jednim mililitarom krvi iz svakog uzorka od 17 pacijenata u pilot kliničkoj studiji. Uzorci su prikupljeni istovremeno sa uzorcima za hemokulture odojčadi i male dece.
Istraživači su usavršili izolaciju DNK i metode mašinskog učenja kako bi smanjili ili eliminisali signale iz ljudske DNK u poređenju sa DNK patogena u uzorcima. „Pošto ljudska DNK značajno nadmašuje DNK patogena, to nam omogućava da bolje otkrijemo „iglu u plastu sena“ koja je patogen“, rekao je Fralei.
Mridu Sinha, jedan od Fraleijevih bivših dr. studenti i sada izvršni direktor Melio, startap kompanije koju su osnovali, optimizovali su algoritam mašinskog učenja kako bi pouzdano otkrili razliku između krivulja topljenja od patogena i pozadinske buke. Algoritam usklađuje krive sa bazom podataka poznatih krivih taljenja DNK. Takođe je u stanju da otkrije krive koje su kreirali organizmi koji nisu u ovoj bazi podataka, a koje bi se mogle pojaviti u uzorku ako sadrži retke ili nove patogene.
Rezultati ne samo da su se potpuno poklapali sa rezultatima iz hemokultura iz istih uzoraka krvi; takođe nisu proizveli nikakve lažne pozitivne rezultate. Nasuprot tome, drugi tipovi testova koji se oslanjaju na amplifikaciju nukleinske kiseline i baze podataka sekvenciranja DNK sledeće generacije će pojačati svaku prisutnu DNK, što će dovesti do lažnih pozitivnih rezultata. Često DNK dospeva u uzorak iz okoline, epruveta, reagensa, kože i još mnogo toga. Kontaminacija uzorka može izazvati probleme sa poznavanjem tumačenja rezultata testa.
„Naš test je uključio procese pripreme uzoraka, tehnike dizajniranja testova i algoritme koji obezbeđuju da detektujemo samo DNK iz netaknutih organizama, što je klinički relevantno“, rekao je Sinha.
Sledeći koraci uključuju sprovođenje šire kliničke studije, kao i proširenje metode na odrasle pacijente.
Fralei i Sinha su licencirali tehnologiju od UC San Diego i suosnivali start-up Melio da komercijalizuju svoj metod.
„Želimo da damo lekarima mogućnost da leče svoje pacijente na osnovu ne agregatnih podataka, već preciznih, tačnih pojedinačnih podataka, omogućavajući zaista personalizovanu medicinu“, rekao je Fralei.
DNK u uzorcima krvi se zagreva, uzrokujući da se topi na temperaturama između 50 i 90 stepeni Celzijusa – oko 120 do 190 stepeni Farenhajta.
Kako se dvostruka spirala DNK topi, veze koje drže zajedno lance DNK se prekidaju. U zavisnosti od sekvence DNK, veze imaju različite snage, a to menja način na koji se lanci odmotavaju jedan od drugog. Ovo stvara jedinstveni otisak prsta zavisan od sekvence, koji istraživači mogu otkriti pomoću posebne boje. Boja uzrokuje da proces odmotavanja daje fluorescentno svetlo, stvarajući ono što istraživači nazivaju krivom topljenja – jedinstveni potpis za svaku vrstu patogena.
U prošlosti, topljenje DNK je proizvelo jednostavne krive koje su se prvenstveno koristile da bi se potvrdilo da je PCR reakcija funkcionisala, ali ovaj novi pristup unapređuje topljenje kako bi se generisali kompleksni potpisi krive taljenja koji su jedinstveni za sekvence gena.
