Tim naučnika sa Univerziteta Kornel i Nacionalne laboratorije u Brukhejvenu Ministarstva energetike SAD (DOE) otkrili su neočekivanu funkciju transportnog proteina i njegovu ulogu u regulatornim mehanizmima biljaka. Njihovo istraživanje, objavljeno u The Plant Cell ranije ove godine, moglo bi da pomogne u smanjenju nedostataka minerala kod ljudi pakovanjem esencijalnih mikronutrijenata u jestive delove biljaka.
Gvožđe je neophodan mineral za ljude. Pored toga što je ključna komponenta hemoglobina – proteina crvenih krvnih zrnaca koji prenosi kiseonik po celom telu – gvožđe pomaže imunološkom sistemu i igra ulogu u kognitivnim funkcijama. Ljudsko telo ne može proizvoditi gvožđe, pa se mora redovno konzumirati.
Biljke, poput spanaća, su jedan od izvora gvožđa, ali njihovi strogi regulatorni mehanizmi sprečavaju preterano akumulaciju minerala jer su toksični za biljku u visokim koncentracijama. Naučnici su, međutim, proučavali transport minerala, poput gvožđa, kako bi otkrili način da se prevaziđu ovi regulatorni mehanizmi i poveća hranljiva vrednost jestivih biljaka.
„Ova priča je počela davno“, objasnila je Olena Vatamaniuk, biljni biolog iz Kornela i šef laboratorije odgovorne za ovo istraživanje. Pre skoro deceniju, Vatamaniuk i njene kolege objavile su iznenađujuće otkriće – transportni protein nazvan oligopeptidni transporter 3 (OPT3) odgovoran je za kretanje gvožđa unutar modela biljke zvane Arabidopsis thaliana, a ne oligopeptida (mali peptidi) za koji je transporter nazvan.
Kao deo ranije studije, istraživači sa Univerziteta u Misuriju otkrili su da smanjenje OPT3 menja distribuciju gvožđa u biljci A. thaliana; koreni su pokazivali znake nedostatka gvožđa, uprkos obilju gvožđa u listovima. Ovo je ukazivalo da je uloga OPT3 bila povezana sa komunikacijom statusa gvožđa od listova, poznatih kao izdanak, do korena.
Ova dva nalaza bila su samo početak komplikovane priče.
„U našoj najnovijoj studiji, želeli smo da iskoristimo naše znanje o ulozi OPT3 da bismo otkrili kako je transporter povezan sa signalizacijom od pucanja do korena“, rekao je Vatamaniuk. Pogled u unutrašnjost biljaka ultrajakim rendgenskim zracima bio je prvi korak – ali OPT3 je za naučnike pripremio još jedno iznenađenje.
Kada naučnici žele da shvate šta protein radi, često biraju da posmatraju šta se ne dešava kada se većina, ako ne i ceo, proteina ukloni iz uzorka. Uklanjanje svih OPT3 proteina bilo bi smrtonosno za biljne vrste korišćene u ovoj studiji, tako da su istraživači genetski izmenili biljke, stvarajući „mutante“ sa manjim brojem OPT3 transportera.
Vatamaniuk i njene kolege želele su da pogledaju kako se distribucija gvožđa kroz vaskularni sistem razlikuje između mutantnih i nepromenjenih biljaka. Istraživači su bili posebno zainteresovani za transportno tkivo, zvano floem, jer su skoro deceniju ranije otkrili da OPT3 pomera gvožđe u ovo tkivo. Floem tipično prenosi hranljive materije iz oblasti gde su oni visoko koncentrisani, poznatih kao izvori, do područja gde su oskudni, poznatih kao ponori. Ovo je u suprotnosti sa vaskularnim tkivom ksilema, koje prenosi vodu i hranljive materije od korena do izdanka.
Jedan od načina da se analizira distribucija gvožđa u tkivima i ćelijama je konfokalna rendgenska fluorescentna slika (C-KSRF), tehnika koju je nedavno razvio Cornell naučnik Artur Vol. Kao i konvencionalna rendgenska fluorescencija (KSRF), ova tehnika koristi jako rendgensko svetlo da otkrije lokacije različitih hemijskih elemenata unutar uzorka. Ali dodavanje veoma malog, specijalnog sočiva koje je dizajnirao Vol, nazvanog konfokalna optika, obezbeđuje dubinu osetljivosti za istraživače da kvantifikuju koncentracije elemenata u određenim odeljcima debelih uzoraka. Istraživači u Cornell-u kreiraju ova sočiva kroz proces koji se zove nanofabrikacija.
Da bi primenili ovu tehniku u ultra-malim razmerama, naučnici iz Kornela doveli su svoj uzorak u jedan od najnaprednijih izvora rendgenske svetlosti na svetu, Nacionalni sinhrotronski izvor svetlosti II (NSLS-II). NSLS-II je DOE Kancelarija za nauku za korisnike u laboratoriji Brookhaven koja proizvodi svetlosne zrake 10 milijardi puta svetlije od sunca.
„NSLS-II je bio jedini objekat sa dovoljno svetlim snopom da bismo dobili rezoluciju koju smo želeli“, objasnio je Ju-Chen Chia, istraživač u Vatamaniukovoj laboratoriji i glavni autor ovog rada. „U to vreme, nijedan drugi objekat nije mogao da nam obezbedi slike C-KSRF rezolucije od jednog mikrona koje su nam bile potrebne.
Prva stanica istraživačkog tima na NSLS-II bila je linija snopa rendgenske spektroskopije submikronske rezolucije (SRKS), koju je vodio Endru Kis. Vol i Kis su postavili niz ogledala da fokusiraju snop rendgenskih zraka do jednog kvadratnog mikrona na deo peteljke – deo biljke koji povezuje listove sa stabljikom.
Interakcije između rendgenskog zraka i peteljke lista emituju fluorescentne rendgenske signale, koji su se širili kroz nanofabrikovanu konfokalnu optiku koja se nalazila samo jedan milimetar dalje pre nego što ih je snimio silicijumski detektor drifta.
„Ovo je bilo zaista izazovno iz tehničke perspektive“, primetio je Kiss. Pored rada sa malom veličinom tačke snopa, istraživači su takođe morali da obezbede da se sakupe rendgenski zraci samo sa površine peteljke lista. Rendgenski zraci prikupljeni iz dubine uzorka bi smanjili rezoluciju i efektivno zamaglili sliku.
Rendgenska fluorescencija sadrži karakteristične energije koje su kao otisci prstiju za svaki element u uzorku. Kiss i naučnici iz Kornela dekodirali su ove rendgenske zrake kako bi otkrili koji su elementi u uzorku, koncentracije tih elemenata i tačno gde se nalaze.
„U originalnom radu smo predložili da je OPT3 važan za učitavanje gvožđa u floemu“, objasnio je Chia. „Dakle, mislili smo da ako analiziramo mutantna biljna vaskularna tkiva koristeći C-KSRF, trebalo bi da vidimo više gvožđa u ksilemu, ali manje gvožđa u floemu mutanta.“
Istraživači su pronašli upravo ono što su tražili – ali su ih naknadne analize iznenadile.
Neki transportni proteini pomeraju više od jednog molekula; u biljkama se gvožđe često transportuje sa cinkom ili manganom. Dakle, analiza distribucije više minerala, pored minerala od interesa, prilično je uobičajena praksa prilikom izvođenja eksperimenata rendgenske fluorescencije.
„Ponekad promena koncentracije jednog minerala izaziva gomilu drugih promena koncentracije u biljkama“, objasnila je Čia. „Gvožđe, bakar, cink i mangan su esencijalni minerali za rast biljaka, tako da volimo da ih sve posmatramo u isto vreme.
Iako je neophodno, bakar obično ne deli transportere sa drugim mineralima u biljkama. Zato su istraživači bili posebno šokirani kada su primetili promene u distribuciji bakra u mutantnoj biljci koje su oponašale one u distribuciji gvožđa mutanta – što ukazuje da je OPT3 takođe transportovao bakar u floem.
„Da nismo doneli naše uzorke u NSLS-II, nikada ne bismo razmatrali da jedan transporter pokreće i gvožđe i bakar u fabrici“, rekao je Vatamaniuk, naglašavajući koliko su ovi rezultati bili neočekivani. „To je prilično neobično.“
„Ovaj rad je bio veliko tehničko dostignuće za SRKS beamline“, primetio je Kis. „Ali to je bila još veća demonstracija stručnosti i saradnje ovde u NSLS-II. Tokom ovih eksperimenata, Kis i Vol su radili sa Rajanom Taperom, vođom rendgenske fluorescentne mikroskopije (KSFM), gde su Čia i njene kolege sprovele komplementarne eksperimente kako bi potvrdile svoje nalaze.
Na KSFM beamlineu, naučnici iz Kornela su želeli da vizuelizuju unutrašnju distribuciju elemenata kroz vaskulaturu embrionalnih biljaka, koje su bile sadržane u zrelim semenima. Iako je sečenje semena i skeniranje njihove površine – poput načina na koji su naučnici proučavali peteljku lista sa C-KSRF – bilo primamljivo, otvaranje semena moglo bi da izazove preraspodelu elemenata. Izlaganje delikatnih struktura kiseoniku takođe može dovesti do hemijskih reakcija koje menjaju njihov elementarni sastav.
„Baš kao što lekari uzimaju CT skeniranje vašeg tela, a da vas ne otvaraju, koristili smo rendgenske zrake na KSFM snopu da bismo napravili ’hemijski’ CT skeniranje mineralnih elemenata unutar semena bez da ih otvorimo“, objasnio je Tapero.
Medicinski CT skenovi se oslanjaju na rotirajući izvor rendgenskih zraka i detektor da bi napravili niz ekspozicija, iz kojih kompjuteri mogu da rekonstruišu slike poprečnog preseka unutrašnjih struktura. Naučnici NSLS-II ne rotiraju rendgenski snop, pa su umesto toga programirali instrumentaciju da rotiraju uzorke semena u rendgenskom zraku dok snimaju signale rendgenske fluorescencije.
„Sjeme je bilo samo pola milimetra u prečniku, što ih je činilo idealnim za skeniranje netaknuto“, objasnio je Tappero. Pošto je svako seme u obliku jajeta bilo prekriveno ultrajakim rendgenskim zracima, fluorescentni signali su mogli da zrače iz centra semena da bi se izmerili silicijumskim detektorom pomeranja.
Nakon prve ekspozicije, instrumentacija je rotirala uzorak za manje od jednog stepena da bi mogao ponovo da se izvuče iz drugog ugla. Instrumentacija je automatski ponavljala ovaj proces sve dok uzorak nije rotiran za punih 360 stepeni. Ova tehnika se zove rendgenska fluorescentna kompjuterska mikrotomografija (F-CMT).
Slike poprečnog preseka F-CMT su izvedene iz fluorescentnih signala kao što su konvencionalne KSRF slike; međutim, naučnici koriste dodatne tehnike kompjuterske rekonstrukcije da bi pružili poglede poprečnog preseka. Koristeći ove slike poprečnog preseka da bi vizuelizovali unutrašnju distribuciju elemenata u embrionalnim biljkama, naučnici su primetili niže koncentracije i gvožđa i bakra u vaskularnim ćelijama mutantnog semena u poređenju sa nepromenjenim semenima. Ovi rezultati su poslužili kao dodatni dokaz da OPT3 transporter pokreće i gvožđe i bakar.
„Doneli smo naše uzorke u NSLS-II kako bismo mogli da posmatramo fiziologiju ovog transportnog proteina i morali smo da se vratimo u našu laboratoriju sa važnim delom slagalice koji leži u centru svega toga“, primetila je Čia. „Sve je trebalo da se spoji.
Istraživači su se vratili u svoje laboratorije u Kornelu kako bi shvatili svoja nova otkrića sa dubokim uronjenjem u genetiku biljke mutanta. Kroz seriju eksperimenata, otkrili su da gvožđe i bakar ne samo da dele transportni protein, već takođe stupaju u interakciju na složenom signalnom putu koji reguliše njihovo preuzimanje kroz ekspresiju gena.
Ovo istraživanje je samo jedan korak ka ublažavanju nedostataka minerala kod ljudi promenom sadržaja hranljivih materija u jestivim biljkama. Vatamaniuk i njene kolege proučavale su A. thaliana, biljku bez trave koja se često koristi u istraživanjima jer se brzo razmnožava i ima kratak genom koji je u potpunosti mapiran. Istraživači sada mogu da iskoriste svoja otkrića da pogledaju funkciju ovog transportnog proteina u biljkama trave kao što su pirinač, pšenica ili ječam.
„Fiziologija biljke može da podesi funkciju transportera“, objasnio je Vatamaniuk. „Dakle, važno je primeniti ovo znanje na druge biljke. Siguran sam da će doći do još otkrića.“
„Želim da izrazim zahvalnost naučnicima NSLS-II jer nam zaista pomažu“, dodala je ona. „Priroda saradnje je toliko važna, ali su takođe tako prijateljski raspoloženi i korisni.
„Imamo toliko ambicioznih ideja“, rekla je Čia, „i one nam pomažu da ih oživimo“.
