Par studija iz laboratorije dr Evangelosa Kiskinisa, vanrednog profesora na Odeljenju za neuromišićne bolesti i neuronauke Ken i Rut Dejvi odeljenja za neurologiju, otkrile su nove ćelijske mehanizme koji su uključeni u dva tipa genetskih amiotrofičnih lateralnih skleroza, ili ALS.
Nalazi poboljšavaju razumevanje ALS-a, progresivne neurodegenerativne bolesti koja napada motorne neurone u mozgu i kičmenoj moždini, i pruža podršku za budući razvoj ciljanih terapija.
Procenjuje se da 32.000 osoba trenutno živi sa ALS-om u SAD, prema Les Turner ALS fondaciji. Postoje dva tipa ALS-a: sporadična (ne-genetska), koja čini više od 90% svih slučajeva ALS-a, i porodična (genetska).
U svom radu objavljenom u Science Advances, Kiskinisov tim je proučavao vrstu porodičnog ALS-a uzrokovanog ponovljenom genetskom sekvencom gena C9ORF72, koji je najveći genetski uzrok ALS-a.
Prema Kiskinisu, zdravi pojedinci mogu imati 20 ponavljanja C9ORF72 u svom genomu, dok pacijenti sa ALS-om mogu imati hiljade. Ova ponavljanja se transkribuju i prevode kroz nekanonske puteve koji proizvode nepravilne RNK i dipeptide (molekule sa dve aminokiseline vezane peptidom) u neuronima.
Kiskinisov tim je pretpostavio da je ovaj kaskadni efekat ono što dovodi do toksičnosti pojačanja funkcije u motornim neuronima u ovoj vrsti ALS-a. To ih je navelo da istraže mehanizme koji ove ponovljene dipeptide (R-DPR) čine sve toksičnijima.
Koristeći računarske i eksperimentalne tehnike, istraživači su otkrili da R-DPR imaju jak afinitet vezivanja za RNK molekule. Zatim su koristili tehniku koja se zove umrežavanje imunoprecipitacije, ili CLIP-sek, da izoluju specifične RNK fragmente i otkrili su da se R-DPR vezuju isključivo za ribozomske RNK. Konkretno, poli-GR dipeptid se vezuje za ribozomalnu RNK, što narušava ribozomalnu homeostazu, proces neophodan za diferencijaciju ćelije i celokupni sastav ćelije.
Koristeći ove nalaze, istraživači su zatim dizajnirali RNK „mamac“, koji prevari poli-GR da se veže sa nečim što izgleda da je ribosomalna RNK — ili u ovom slučaju mamac. I u modelima in vivo i u iPSC neuronima dobijenim od pacijenata sa C9ORF72 mutacijama, molekul mamaca je inhibirao toksičnost.
„Pokazali smo korišćenjem više različitih pristupa da se molekul koji smo dizajnirali — „mamac“ — vezuje veoma visoko i specifično za ovaj poli-GR protein, a vezivanjem za njega sprečava ga da se veže za ribozomalnu RNK i sprečava da uđe u jezgro , gde postaje najtoksičniji“, rekao je Kiskinis.
„To služi kao dokaz principa ideje da molekul RNK koji ima ove kapacitete ‘mamca’ može biti terapeutski i takođe jača hipotezu da je veliki deo toksičnosti od mutacije C9ORF72 povezan sa narušavanjem ribozomalne biologije.“
Istraživači sada optimizuju hemiju molekula mamca i imaju za cilj da ga testiraju na drugim modelima ALS-a, kaže Kiskinis.
„Uzbuđeni smo činjenicom da neuroni izvedeni iz iPSC-a pacijenata koji imaju ove mutacije opstaju mnogo duže kada im damo ovaj molekul mamaca, što znači da čini nešto dobro. Samo treba da shvatimo da li bi to moglo biti održiva i transformativna terapija“, rekao je Kiskinis.
Postoji 30 poznatih gena povezanih sa porodičnim oblicima ALS-a, ali da li svaki genetski pokretač doprinosi samo jednom opštem tipu ALS-a ili više tipova ostaje pitanje koje se nazire na terenu, kaže Kiskinis.
Da bi se pozabavili ovim pitanjem, prema njihovoj studiji objavljenoj u Cell Reports, Kiskinisov tim je koristio motorne neurone kičmene kičmene ćelije izazvane pluripotentnim matičnim ćelijama (iPSC) kako bi razvio model drugog najčešćeg tipa porodičnog ALS-a, koji je uzrokovana mutacijama u genu SOD1 i očigledna je u dva procenta svih slučajeva ALS.
„Znamo iz rada koji je obavljen na terenu u poslednjih 20 godina, da ova mutacija izaziva toksičnost kroz efekte pojačanja funkcije. Znamo da mutacije dovode do pogrešnog savijanja proteina, a pogrešno savijanje pokreće kaskadu koja dovodi do disfunkcija. Ali kako se to dešava, ne razumemo baš“, rekao je Kiskinis.
Istraživači su koristili vremensku proteomiku da uporede proteome kontrolnih iPSC neurona i iPSC neurona sa mutacijom SOD1 i uporedili su stopu degradacije proteina (recikliranje i zamena starih proteina) između oba seta neurona.
U mutantnim-SOD1 iPSC neuronima, otkrili su da se drugi uzročni protein ALS-a — protein koji sadrži valosin (VCP)—razgrađuje sporije nego u izogenim kontrolnim iPSC neuronima. Ova spora degradacija proteina na kraju je prouzrokovala da VCP manje reaguje sa određenim proteinima, a više sa drugim proteinima.
„Ovo je prilično uzbudljivo jer se smatra da mutacije u VCP-u koje mogu izazvati ALS deluju na sličan način“, rekao je Kiskinis.
Istraživači su zatim imali za cilj da utvrde da li je ova izmenjena funkcija VCP igrala ulogu u toksičnosti posredovanoj SDO1. I kod mutantnih-SOD1 iPSC neurona pacijenata i kod modela C. elegans (vrsta okruglih crva) mutantnog SOD1, istraživači su otkrili da kada je VCP bio prekomerno izražen, toksičnost se smanjila, a kada je funkcija VCP inhibirana, toksičnost se povećala.
„Ovaj rad i rad koji smo radili u našoj laboratoriji u poslednjih nekoliko godina, pokazuju da iako genetski uzroci mogu biti različiti, uvek postoji neka vrsta mehaničkog preklapanja kada su u pitanju uzroci disfunkcije u ovim ćelijama“, rekao je Kiskinis.
Ovo je važno, dodao je Kiskinis, jer nalazi mogu da informišu o dizajnu budućih kliničkih ispitivanja i poboljšaju primenu ciljanih terapija. Ubuduće, Kiskinis je rekao da njegov tim želi da utvrdi da li je VCP efikasna terapeutska meta za pacijente sa mutacijom SOD1, kao i za druge vrste ALS-a.
