Istraživači su razvili i demonstrirali novu metodu za visoko propusno jednoćelijsko sortiranje koja koristi stimulisanu Ramanovu spektroskopiju, a ne tradicionalni pristup fluorescentno aktiviranog sortiranja ćelija. Novi pristup bi mogao da ponudi nedestruktivan način sortiranja ćelija bez etiketa za različite primene, uključujući mikrobiologiju, otkrivanje raka i ćelijsku terapiju.
Jing Zhang sa Bostonskog univerziteta će predstaviti ovo istraživanje na Frontiers in Optics + Laser Science (FiO LS), koje će se održati 9-12. oktobra 2023. u Kongresnom centru Greater Tacoma u Takomi (oblast Velikog Sijetla), Vašington.
„Naš pristup (stimulisano izbacivanje ćelija aktivirano Ramanom, S-RACE) nudi inovativan način sortiranja ćelija na osnovu njihovog unutarćelijskog hemijskog sastava na način visoke propusnosti“, objašnjava Zhang.
„Različite nizvodne fenotipske i/ili genomske analize mogu se primeniti na odvojene ćelijske populacije. Štaviše, njegova kompatibilnost sa malim ćelijama je korisna za sortiranje bakterija i drugih mikroorganizama. Na primer, korišćenjem S-RACE, patogena ili ćelija koje pokazuju specifične metaboličke profile mogu biti direktno uhvaćeni iz njihovog prirodnog staništa, na primer, vodenih tela, zemljišta ili gastrointestinalnog trakta. Naknadno sekvenciranje omogućava zadatke kao što su identifikacija taksonomije ćelija i procena ekološke funkcije.“
Protočna citometrija se koristi u mnogim biomedicinskim poljima za brzo brojanje i karakterizaciju različitih tipova ćelija, uključujući krvne ćelije, matične ćelije, ćelije raka i mikroorganizme. Sortiranje ćelija na osnovu njihove veličine, granularnosti ili ekspresije površine ćelije i intracelularnih molekula može se koristiti za sticanje uvida u biološke procese ili za izdvajanje ćelija sa određenim karakteristikama za dodatnu analizu.
Iako se većina savremenih metoda sortiranja ćelija visoke propusnosti oslanja na fluorescentne signale za sortiranje, fluorescentne oznake mogu poremetiti funkciju ćelije i ne mogu se koristiti sa malim molekulima. Ramanova spektroskopija je obećavajuća alternativa jer nudi merenje jedne ćelije bez etiketa i bez destrukcije dobijanjem hemijskog otiska prsta ćelije. Međutim, bilo je teško postići i jak Raman signal i praktičnu mikrofluidnu postavku za ćelije za snimanje.
U novom radu, istraživači opisuju kako su prevazišli ovaj izazov korišćenjem stimulisane Ramanove spektroskopije, koja proizvodi signal nekoliko redova veličine veći od najčešće korišćenog spontanog Ramanovog rasejanja. Za sortiranje se dobijaju stimulisane Ramanove slike da bi se identifikovali objekti ili ćelije od interesa, a zatim 2D galvo ogledala usmeravaju pulsni laser od 532 nm na ćeliju. Konačno, akusto-optički modulator se koristi kao brzi birač impulsa tako da se pojedinačni laserski impulsi mogu koristiti za potiskivanje izabrane ćelije u kolektor. Svako izbacivanje traje samo oko 8 milisekundi.
Istraživači su prvo demonstrirali svoju stimulisanu metodu izbacivanja ćelija aktiviranom Ramanom koristeći mešavinu 1-mikronskih polimernih kuglica, postižući oko 95% čistoće i 98% protoka sa oko 14 izbacivanja koje se obavljaju svake sekunde. Takođe su pokazali da se metoda može koristiti sa fiksnim bakterijama.
Da bi primenili metod sortiranja na žive ćelije kvasca, istraživači su dodali tanak sloj agara u modul za izbacivanje kako bi zaštitili ćelije od toplote i sušenja i koristili posudu sa agarom kao sakupljač da bi obezbedili više jastuka i vlage tokom sletanja ćelije. Istraživači su koristili sistem za izbacivanje približno 340 ćelija kvasca i primetili uspešan rast ćelija u prijemnoj posudi nakon oko 40 sati. Takođe su pokazali da se drugi pristupi genomske analize, kao što je kvantitativna lančana reakcija polimeraze, mogu integrisati sa pristupom sortiranja.
