Otkako je uređivanje gena postalo izvodljivo, istraživači i zdravstveni zvaničnici su tražili alate koji mogu brzo i pouzdano razlikovati genetski modifikovane organizme od onih koji se javljaju u prirodi. Iako naučnici mogu da donesu ove odluke nakon pažljive genetske analize, istraživačke i nacionalne bezbednosne zajednice dele dugogodišnju neispunjenu potrebu za modernizovanim alatom za skrining. Nakon pojave SARS-CoV-2, svet je postao svestan ove potrebe.
Sada se grade takvi alati.
Skup tehnika — jedna platforma zasnovana na laboratoriji i četiri računarska modela analize DNK sekvence — razvijen je i usavršen tokom šestogodišnjeg programa finansiranog od strane Obaveštajnih naprednih istraživačkih projekata Sjedinjenih Država (IARPA). Ovi pristupi imaju potencijal da dramatično promene trenutne mogućnosti skrininga za otkrivanje konstruisanih organizama.
Tim Suzan Celniker u Nacionalnoj laboratoriji Lavrence Berkelei (Berkelei Lab) izabran je da vodi fazu testiranja i evaluacije programa, pod nazivom Finding Engineering-Linked Indicators, ili FELIKS. Ona i njene kolege dizajnirale su i proizvele sve izazovnije biološke uzorke i procenile koliko su dobro alati napravljeni od strane akademskih i industrijskih grupa koje su učestvovale.
„Ono što je FELIKS program otkrio u svojim prvim mesecima je da sposobnost da se efikasno identifikuju modifikovani organizmi u životnoj sredini ne postoji. I tako je program zaista započeo na temeljima razvoja prve u klasi sposobnosti za identifikaciju modifikovanih organizama,“ rekao je Ben Braun, kompjuterski biolog u laboratoriji Berkli, koji je zajedno sa Celnikerom vodio dizajn projekta. „To je veoma važan program po tome što je stvorio alate za popunjavanje važnog segmenta našeg prostora nacionalne bezbednosti.
Da bi procenio rad koji su obavili njeni istraživački timovi, IARPA je angažovala nacionalne laboratorije da izvrše testiranje i evaluaciju. Ovaj proces osigurava da mogućnosti i alati koji su razvijeni u okviru programa kao što je FELIKS mogu postići iste rezultate kao što su prijavili istraživači i ispunjavaju programske metrike, omogućavajući evaluaciju napretka u okviru programa. Da bi se osiguralo da će testovi biti što korisniji za aplikacije nacionalne bezbednosti, timovi su procenili svoje performanse sa uzorcima na osnovu trenutnih i potencijalnih scenarija iz stvarnog sveta.
„Dobili smo spisak svakog virusa i mikroba za koje ljudi brinu i oni su ušli u uzorke. Ideja je da ovi sistemi za testiranje budu pripremljeni za situaciju u kojoj je potrebno samouvereno proceniti da li je neki organizam, bio on sisar , biljka, mikrob ili virus, napravljen je i sada cirkuliše u okruženju neograničeno“, kaže Celniker.
Ukupno, naučnici iz Berkli laboratorije, Pacifičke severozapadne nacionalne laboratorije i Ministarstva poljoprivrede Sjedinjenih Država proizveli su skoro 200 jedinstvenih uzoraka organizama sa bezopasnim modifikacijama u rasponu od velikih brisanja ili umetanja DNK sekvence pa sve do veoma suptilnih pojedinačnih nukleotidnih promena napravljenih korišćenjem CRISPR. Svaka grupa za testiranje dobila je uzorke koji sadrže izmenjene organizme, kao i nemodifikovane kontrolne uzorke koji sadrže nemodifikovane organizme – poznate kao „divlji tip“ – koji nikada ranije nisu bili u potpunosti sekvencionirani, tako da genomi nisu bili dostupni ni u jednoj bazi podataka za poređenje. Uzorci su uključivali virusne čestice i ćelije bakterija, sisara i gljivica. Ovi zaslepljeni uzorci su predstavljali potencijalne ljudske patogene, kao što su HIV i E. coli, patogene koji inficiraju biljke i projektovane kompleksne vrste. Da bi se osiguralo zdravlje i sigurnost učesnika, svi mikrobni ili virusni uzorci stvoreni za testiranje bili su neinfektivni i svi su kontrolisani pod strogim procedurama biološke bezbednosti.
Deo za testiranje i evaluaciju FELIKS-a je podeljen u četiri faze, gde je svaka sledeća faza imala teže uzorke. Grupe sa kandidatskim testovima eliminisane su usput ako njihova tehnika nije bila dovoljno dobra.
U početku, grupe za testiranje su dobijale prečišćene uzorke sa samo po jednim organizmom i dobijale su višestruke uzorke da bi utvrdile da li je tehnika testiranja dala ponovljive rezultate. Na kraju, testeri su dobili mešovite uzorke dizajnirane da približe uslove testiranja u stvarnom svetu. „Za poslednju rundu, dali smo im mešavine do 10 divljih tipova i konstruisanih organizama sa različitim mutacijama u sebi da oponašaju kako bi uzorak zemljišta mogao da izgleda. I zapravo smo im dali dva uzorka zemljišta, kao i stvarne uzorke mikrobioma iz digestivni trakt krave i digestivni trakt miša“, rekao je Celniker. „Tako da su dobili veoma složene uzorke koji su bili zaista izazovni.“
Celniker i Brovn su dodatno izazvali grupe za testiranje dizajnom uzoraka koji su uključivali prirodne genetske neobičnosti. Na primer, predstavili su uzorke koji sadrže bakterije koje su stekle nove gene zamenom plazmida — kružnih delova DNK koji su odvojeni od glavnog genoma ćelije — sa drugim vrstama mikroba. Sticanje gena iz plazmida je vrlo uobičajeno kod jednoćelijskih organizama, i upravo kroz ovaj mehanizam sojevi bakterija mogu vrlo brzo da steknu nove osobine kao što je otpornost na antibiotike.
Takođe su ubacili neke hibridizovane uzorke gripa koji nisu mogli da se formiraju prirodno (uprkos sklonosti virusa za genetsko ukrštanje) jer sojevi nikada nisu cirkulisali u isto vreme ili na istim kontinentima. Događaji skremlinga gena u stvarnom svetu, poput ovih, otežavaju razlikovanje između prirodnih i sintetičkih dodataka gena, ali sposobnost da se to uradi je suštinska sposobnost modifikovanog alata za detekciju organizma.
U tom cilju, vođe programa IARPA postavili su ambiciozan cilj za tehnologije testiranja od 99% specifičnosti (ne više od 1% divljih tipova pogrešno identifikovanih kao modifikovanih) i 90% osetljivosti (ne više od 10% testova može pogrešno identifikovati modifikovani organizam kao divlji tip). Četiri tehnike koje su prošle do kraja četvrte faze testiranja i koje će biti korisne za identifikaciju bioloških pretnji bile su laboratorijski test kompanije Draper i računarski modeli kompanija Raitheon, Ginkgo Biovorks i Noblis. Pokazalo se da su ove tehnike odlične u identifikaciji organizama divljeg tipa, a ansambl računarskih modela koji je razvio Berkelei Lab postigao je 99% specifičnosti.
Osetljivost u identifikaciji konstruisanih organizama pojedinačnih modela bila je između 55%-70%. Ali ansambl je uspeo da postigne približno 72% osetljivosti pod unakrsnom validacijom, što se dogodilo kada je testiran na novim skupovima podataka sekvence. Ukupne performanse pojedinačnih modela i ansambla su pokazale značajno poboljšanje u odnosu na postojeće najsavremenije mogućnosti.
Jedan od razloga zašto je tako teško razlikovati prirodne i konstruisane organizme je taj što naučnici širom sveta koriste mnogo različitih baza podataka i programa za pregled i skladištenje podataka o sekvenci genoma. I povrh toga, ljudi koriste različita imena i termine da opišu gene i predvide njihove funkcije na osnovu sekvenci – proces koji se zove anotacija. Dakle, uprkos činjenici da sve više i više vrsta ima sekvencioniran genom, podaci nisu nužno laki za korišćenje.
Da bi popravila ovaj problem, Celniker je angažovala svog kolegu iz oblasti Biosciences, Krisa Mungala, naučnika iz računarskog osoblja, da vodi razvoj softverskog programa i baze podataka otvorenog pristupa. Rezultat je bila Sinbio Schema, koja katalogizuje označene genome projektovanih i divljih organizama relevantnih za nacionalnu bezbednost koristeći standardizovani jezik. Svaki uzorak koji je Celniker tim kreirao za testere je takođe dodat u novu bazu podataka i obeležen standardizovanim jezikom, pružajući resurs koji je lak za korišćenje budućim istraživačima.
„Ovo je prva kurirana baza podataka i zajednički jezik za projektovane i neinženjerske organizme, i oni su zaista morali da naprave avion u letu jer ništa slično nije postojalo ranije, a program bi bio osakaćen bez toga“, rekao je Braun.
„Pravi problem nastaje kada više istraživačkih grupa pokušava da podeli i uporedi rezultate“, objasnio je Mark Miler, programer softvera u Mungalovoj grupi. „Ako postoje interne nedoslednosti ili drugi problemi u bazi podataka tima, ili ako postoje strukturne ili nomenklaturne razlike između baza podataka timova, onda niko ne može reći da li se podaci jednog tima slažu sa podacima drugih timova. Ovo primorava naučnike da zamorno ručno pregledaju napomene radi tačnih poređenja.
Nadovezujući se na uspeh programa FELIKS, naučnici iz laboratorije Berkli planiraju da prošire bazu podataka dodavanjem novih organizama koji bi mogli da se eksploatišu kao biološko oružje, i pozivaju druge grupe da dodaju i nove sekvence. U međuvremenu, Braun se raduje korišćenju uredno organizovane baze podataka za obuku modela mašinskog učenja, što će dovesti do još boljih modifikovanih alata za otkrivanje organizama u budućnosti.
Gledajući sledeće korake, tim se nada da će iskoristiti znanje i tehnike stečene iz FELIKS programa za razvoj boljih alata za otkrivanje sposobne za praćenje na nivou ekosistema za otkrivanje pretnji u okruženju u realnom vremenu – sposobnost koju Braun opisuje kao „NORAD za biologiju.“
