Moždano tkivo je jedan od najzamršenijih uzoraka tkiva sa kojima su se naučnici, verovatno, ikada bavili. Prepun nemerljivog broja informacija, ljudski mozak je najsofisticiraniji računarski uređaj sa svojom mrežom od oko 86 milijardi neurona.
Razumevanje takve složenosti je težak zadatak i stoga su za napredak potrebne tehnologije za otkrivanje sitnih, složenih interakcija koje se odvijaju u mozgu na mikroskopskim razmerama. Imaging je stoga alat koji omogućava u neuronauci.
Nova tehnologija snimanja i virtuelne rekonstrukcije koju je razvila grupa Johana Dancla, na Institutu za nauku i tehnologiju Austrije (ISTA), predstavlja veliki skok u slikovnoj aktivnosti mozga i prikladno je nazvana LIONESS—nanoskopija optimizovana za informacije uživo koja omogućava zasićenu segmentaciju. Njihov rad je objavljen u Nature Methods.
LIONESS je sistem za snimanje, rekonstrukciju i analizu živog moždanog tkiva sa sveobuhvatnošću i prostornom rezolucijom koja do sada nije bila moguća.
„Sa LIONESS-om, po prvi put, moguće je dobiti sveobuhvatnu, gustu rekonstrukciju živog moždanog tkiva. Snimanjem tkiva više puta, LIONESS nam omogućava da posmatramo i merimo dinamičku ćelijsku biologiju u mozgu, koja ide svojim tokom“, kaže prvi autor Filip Velicki. „Izlaz je rekonstruisana slika ćelijskih aranžmana u tri dimenzije, sa vremenom koje čini četvrtu dimenziju, pošto se uzorak može snimiti tokom minuta, sati ili dana“, dodaje on.
Uz LIONESS, neuronaučnici mogu da snime živo moždano tkivo i postignu 3D slike visoke rezolucije bez oštećenja živog uzorka. LIONESS može da slika i rekonstruiše uzorak na način koji razjašnjava mnoge dinamičke strukture i funkcije u živom moždanom tkivu. Kredit: © Julia Liudchik ISTA
Snaga LIONESS-a leži u prefinjenoj optici i u dva nivoa dubokog učenja — metodu veštačke inteligencije — koji čine njegovu srž. Prvi poboljšava kvalitet slike, a drugi identifikuje različite ćelijske strukture u gustom neuronskom okruženju.
Naftovod je rezultat saradnje između Danzl grupe, Bikel grupe, Jonas grupe, Novarino grupe i ISTA-inih naučnih službi, kao i drugih međunarodnih saradnika. „Naš pristup je bio da okupimo dinamičnu grupu naučnika sa jedinstvenom kombinovanom ekspertizom preko granica discipline, koji zajedno rade na zatvaranju tehnološkog jaza u analizi moždanog tkiva“, kaže Johan Dancl iz ISTA.
Ranije je bilo moguće dobiti rekonstrukcije moždanog tkiva korišćenjem elektronske mikroskopije. Ovaj metod prikazuje uzorak na osnovu njegovih interakcija sa elektronima. Uprkos svojoj sposobnosti da snimi slike u rezoluciji od nekoliko nanometara — milioniti deo milimetra, elektronska mikroskopija zahteva da se uzorak fiksira u jednom biološkom stanju, koje treba fizički da se podeli da bi se dobile 3D informacije. Shodno tome, ne mogu se dobiti nikakve dinamičke informacije.
Još jedna ranije poznata tehnika svetlosne mikroskopije omogućava posmatranje živih sistema i beleženje volumena netaknutog tkiva tako što ih seče „optički“, a ne fizički. Međutim, svetlosna mikroskopija je ozbiljno otežana u svojoj moći razrešavanja samim svojstvima svetlosnih talasa koje koristi za generisanje slike. Njegova najbolja rezolucija je nekoliko stotina nanometara, previše gruba da bi uhvatila važne ćelijske detalje u moždanom tkivu.
Koristeći svetlosnu mikroskopiju super rezolucije, naučnici mogu da razbiju ovu rezolucionu barijeru. Nedavni rad u ovoj oblasti, nazvan SUSHI (Super-resolution Shadov Imaging), pokazao je da primena molekula boje na prostore oko ćelija i primena tehnike super-rezolucije koja je dobila Nobelovu nagradu STED (Stimulated Emission Depletion) mikroskopija otkriva super razrešene „senke“ “ svih ćelijskih struktura i tako ih vizualizuje u tkivu.
Ipak, bilo je nemoguće snimiti čitave količine moždanog tkiva uz poboljšanje rezolucije koje odgovara složenoj 3D arhitekturi moždanog tkiva. To je zato što povećanje rezolucije takođe povlači za sobom veliko opterećenje slikovnom svetlošću na uzorku, što može oštetiti ili „spržiti“ suptilno živo tkivo.
U tome leži snaga LIONESS-a, koji je razvijen za, prema autorima, „brze i blage“ uslove snimanja, čime se uzorak održava u životu. Tehnika to čini dok obezbeđuje izotropnu super-rezoluciju — što znači da je podjednako dobra u sve tri prostorne dimenzije — koja omogućava vizualizaciju ćelijskih komponenti tkiva u detaljima rešenim na 3D nanoskali.
LIONESS prikuplja samo onoliko informacija iz uzorka koliko je potrebno tokom koraka snimanja. Nakon toga sledi prvi korak dubokog učenja kako bi se popunile dodatne informacije o strukturi moždanog tkiva u procesu koji se zove „restauracija slike“. Na ovaj inovativan način postiže rezoluciju od oko 130 nanometara, dok je dovoljno nežan za snimanje živog moždanog tkiva u realnom vremenu. Zajedno, ovi koraci omogućavaju drugi korak dubokog učenja, ovog puta da bi se dobio smisao izuzetno složenih slikovnih podataka i identifikovale neuronske strukture na automatizovan način.
„Interdisciplinarni pristup nam je omogućio da razbijemo isprepletena ograničenja u snazi razrešavanja i izloženosti svetlu živom sistemu, da shvatimo složene 3D podatke i da spojimo ćelijsku arhitekturu tkiva sa molekularnim i funkcionalnim merenjima“, kaže Danzl.
Za virtuelnu rekonstrukciju, Danzl i Velicki su se udružili sa stručnjacima za vizuelno računarstvo, Bikel grupom iz ISTA i grupom koju je predvodio Hanspeter Pfister sa Univerziteta Harvard, koji su doprineli svojoj stručnosti u automatizovanoj segmentaciji—procesu automatskog prepoznavanja ćelijskih struktura u tkivu— i vizuelizacija, uz dalju podršku ISTA-inog naučnika za analizu slike Kristofa Somera.
Za sofisticirane strategije označavanja doprineli su neuronaučnici i hemičari iz Edinburga, Berlina i ISTA. Bilo je moguće premostiti funkcionalna merenja, tj. očitati ćelijske strukture zajedno sa biološkom signalizacijom u istom živom neuronskom kolu.
Ovo je urađeno snimanjem fluksa kalcijumovih jona u ćelije i merenjem ćelijske električne aktivnosti u saradnji sa Jonas grupom na ISTA. Novarino grupa je doprinela ljudskim cerebralnim organoidima, često nazvanim mini mozgovima koji oponašaju razvoj ljudskog mozga. Autori ističu da je sve ovo omogućeno stručnom podrškom vrhunskih naučnih službi ISTA.
Struktura i aktivnost mozga su veoma dinamične; njegove strukture se razvijaju kako mozak obavlja i uči nove zadatke. Ovaj aspekt mozga se često naziva „plastičnost“. Stoga je posmatranje promena u arhitekturi moždanog tkiva od suštinskog značaja za otključavanje tajni iza njegove plastičnosti. Novi alat razvijen u ISTA pokazuje potencijal za razumevanje funkcionalne arhitekture moždanog tkiva i potencijalno drugih organa otkrivanjem subćelijskih struktura i hvatanjem kako se one mogu promeniti tokom vremena.
