Genomske studije pacijenata obolelih od raka otkrile su hiljade mutacija povezanih sa razvojem tumora. Međutim, za ogromnu većinu tih mutacija, istraživači nisu sigurni kako one doprinose nastanku raka jer ne postoji jednostavan način da se prouče na životinjskim modelima.
U napretku koji bi mogao pomoći naučnicima da naprave udubljenje u toj dugačkoj listi neistraženih mutacija, istraživači MIT-a razvili su način da lako konstruišu specifične mutacije povezane sa rakom u modele miša.
Koristeći ovu tehniku, koja se zasniva na CRISPR tehnologiji za uređivanje genoma, istraživači su kreirali modele nekoliko različitih mutacija gena Kras koji izaziva rak, u različitim organima. Oni veruju da bi se ova tehnika takođe mogla koristiti za skoro bilo koju drugu vrstu mutacije raka koja je identifikovana.
Takvi modeli bi mogli pomoći istraživačima da identifikuju i testiraju nove lekove koji ciljaju na ove mutacije.
„Ovo je izuzetno moćan alat za ispitivanje efekata u suštini bilo koje mutacije od interesa na netaknutu životinju, i to za delić vremena potrebnog za ranije metode“, kaže Tajler Džeks, David H. Koch profesor biologije, član sa Koch instituta za integrativno istraživanje raka na MIT-u, i jedan od starijih autora nove studije.
Francisco Sanchez-Rivera, docent biologije na MIT-u i član Instituta Koch, i David Liu, profesor na Odsjeku za hemiju i hemijsku biologiju Univerziteta Harvard i član jezgre instituta Broad Instituta, takođe su stariji autori studija, koja se danas pojavljuje u Nature Biotechnologi.
Zack Eli Ph.D. ’22, bivši diplomirani student MIT-a koji je sada gostujući naučnik na MIT-u, i MIT diplomirani student Nicolas Mathei-Andrevs su vodeći autori rada.
Testiranje lekova protiv raka na modelima miševa je važan korak u određivanju da li su oni dovoljno bezbedni i efikasni da se uključe u klinička ispitivanja na ljudima. Tokom proteklih 20 godina, istraživači su koristili genetski inženjering da kreiraju modele miša brisanjem gena za supresiju tumora ili aktiviranjem gena koji promovišu rak. Međutim, ovaj pristup je radno intenzivan i zahteva nekoliko meseci ili čak godina za proizvodnju i analizu miševa sa jednom mutacijom povezanom sa rakom.
„Podiplomski student može da izgradi ceo doktorat oko izgradnje modela za jednu mutaciju“, kaže Eli. „Sa tradicionalnim modelima, bile bi potrebne decenije da se sustigne sve mutacije koje smo otkrili pomoću Atlasa genoma raka.
Sredinom 2010-ih, istraživači su počeli da istražuju mogućnost korišćenja CRISPR sistema za uređivanje genoma kako bi lakše učinili kancerogene mutacije. Neki od ovih radova su se desili u Džeksovoj laboratoriji, gde su Sančez-Rivera (tada diplomirani student MIT-a) i njegove kolege pokazali da mogu da koriste CRISPR da brzo i lako izbace gene koji se često gube u tumorima. Međutim, iako ovaj pristup olakšava izbacivanje gena, on nije pogodan za ubacivanje novih mutacija u gen jer se oslanja na mehanizme popravke DNK ćelije, koji imaju tendenciju da unose greške.
Inspirisan istraživanjem iz Liuove laboratorije na Institutu Broad, tim MIT-a je želeo da smisli način da izvrši preciznije uređivanje gena koji bi im omogućio da naprave veoma ciljane mutacije bilo na onkogene (geni koji pokreću rak) ili supresore tumora.
U 2019. godini, Liu i kolege su prijavili novu verziju CRISPR-ovog uređivanja genoma pod nazivom prime editing. Za razliku od originalne verzije CRISPR-a, koja koristi enzim nazvan Cas9 za stvaranje dvolančanih prekida u DNK, primena montaža koristi modifikovani enzim nazvan Cas9 nikaza, koji je spojen sa drugim enzimom koji se zove reverzna transkriptaza. Ovaj fuzioni enzim preseca samo jedan lanac spirale DNK, čime se izbegava uvođenje dvolančanih prekida DNK koji mogu dovesti do grešaka kada ćelija popravi DNK.
Istraživači sa MIT-a dizajnirali su svoje nove modele miša tako što su inžinjerivali gen za enzim glavnog urednika u ćelije zametne linije miševa, što znači da će biti prisutan u svakoj ćeliji organizma. Kodirani enzim glavnog uređivača omogućava ćelijama da kopiraju RNK sekvencu u DNK koja je ugrađena u genom. Međutim, gen glavnog urednika ostaje tih sve dok se ne aktivira isporukom specifičnog proteina zvanog Cre rekombinaza.
Pošto je glavni sistem za uređivanje instaliran u genomu miša, istraživači mogu pokrenuti rast tumora ubrizgavanjem Cre rekombinaze u tkivo gde žele da se mutacija raka ekspresuje, zajedno sa RNK koja vodi Cas9 nikazu da izvrši specifičnu izmenu u genom ćelija. RNK vodič može biti dizajniran da indukuje pojedinačne supstitucije DNK baze, delecije ili dodatke u određenom genu, omogućavajući istraživačima da stvore bilo koju mutaciju raka koju žele.
Da bi demonstrirali potencijal ove tehnike, istraživači su napravili nekoliko različitih mutacija u Kras genu, koji pokreće oko 30% svih karcinoma kod ljudi, uključujući skoro sve adenokarcinome pankreasa. Međutim, nisu sve Krasove mutacije identične. Mnoge Kras mutacije se javljaju na lokaciji poznatoj kao G12, gde se nalazi aminokiselina glicin, a u zavisnosti od mutacije, ovaj glicin se može pretvoriti u jednu od nekoliko različitih aminokiselina.
Istraživači su razvili modele četiri različite vrste Kras mutacija pronađenih kod raka pluća: G12C, G12D, G12R i G12A. Na njihovo iznenađenje, otkrili su da tumori nastali u svakom od ovih modela imaju veoma različite osobine. Na primer, G12R mutacije su proizvele velike, agresivne tumore pluća, dok su G12A tumori bili manji i napredovali su sporije.
Saznavanje više o tome kako ove mutacije različito utiču na razvoj tumora moglo bi pomoći istraživačima da razviju lekove koji ciljaju svaku od različitih mutacija. Trenutno postoje samo dva leka odobrena od strane FDA koji ciljaju na Kras mutacije, i oba su specifična za G12C mutaciju, koja čini oko 30% Kras mutacija koje se vide kod raka pluća.
Istraživači su takođe koristili svoju tehniku za stvaranje organoida pankreasa sa nekoliko različitih tipova mutacija u tumor supresorskom genu p53, i sada razvijaju mišje modele ovih mutacija. Oni takođe rade na generisanju modela dodatnih Kras mutacija, zajedno sa drugim mutacijama koje pomažu u stvaranju otpornosti na Kras inhibitore.
„Jedna stvar zbog koje smo uzbuđeni je da posmatramo kombinacije mutacija uključujući Kras mutacije koje pokreću tumorigenezu, zajedno sa mutacijama povezanim sa otpornošću“, kaže Mathei-Andrevs. „Nadamo se da će nam to pomoći ne samo u tome da li mutacija izaziva otpor, već i kako izgleda rezistentni tumor?“
Istraživači su omogućili miševe sa glavnim sistemom za uređivanje urađenim u njihovom genomu preko skladišta u laboratoriji Jackson, i nadaju se da će druge laboratorije početi da koriste ovu tehniku za svoja istraživanja mutacija raka.
